放射毛霉3278羧肽酶水解产物的制备及体外抑菌活性

放射毛霉3278羧肽酶水解产物的制备及体外抑菌活性

羧酶是一种从羧基末端转化得到的水解酶，该酶从末端提取氨基酸。从该活性物质中获得的产物和游离氨基酸的性质对提出的乳化和豆豆菌素的形成非常重要。因为蛋白质酶解产物的苦味源于产物中羧基末端是疏水性氨基酸的肽,尤其当羧基末端是亮氨酸时,肽的苦味就更强。羧肽酶切除苦味肽羧基末端的疏水性氨基酸,引起肽的疏水性降低,苦味随之减弱。曲霉羧肽酶、小麦羧肽酶及动物来源的羧肽酶作用于酪蛋白和大豆蛋白水解产物的研究结果都证实了羧肽酶具有脱苦作用。潘进权等通过研究提出毛霉分泌的肽酶水解酶含有较为丰富的氨基肽酶、羧基肽酶或生成小肽的肽酶,而且可能正是这些外肽酶参与了水解肽类形成氨基酸的作用促使腐乳、无苦味大豆多肽等独特品质和良好风味的形成。本课题组研究证实了毛霉发酵液也能够明显除去大豆蛋白水解产物的苦味,具有很强的脱苦能力,而且对合成肽N-CBZ-Ile-Leu表现明显羧肽酶活性。2004年,马晓航等报道了从雅致放射毛霉中分离纯化出一种氨肽酶。Actinomucorelegans即雅致放射毛霉(属),属于毛霉科,被认为是豆腐乳生产的最优良菌种。本研究通过固态发酵雅致放射毛霉菌株Actinomucorelegans3.2778,对酶液中羧肽酶的性质进行了较为全面的探索。为毛霉羧肽酶的分离纯化以及脱苦酶制剂的研究和开发奠定理论基础和指导依据。1材料和方法1.1材料和机器1.1.1细菌和培养基雅致放射毛霉Actinomucorelegans3.2778:北京王致和腐乳厂提供。斜面培养基:PDA培养基。1.1.2聚op、苯甲基磺酰氟-二硫苏糖酯、碘乙酸、二硫苏糖酸3-5,10-四氢-1,10-四氢-1,10-四氢-3,10-种甲基苯磺酸盐mttN-苄氧羰酰基-L-苯丙胺酰-L-亮氨酸(N-CBZ-Phe-Leu)、茚三酮、1,10-邻菲啰啉(OP)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、碘乙酸:Sigma公司;二异丙基磷酰氟(DFP)、对氯汞苯甲酸(PCMB)Merck公司;DTT(二硫苏糖醇)、L-亮氨酸:北京鼎国生物技术有限责任公司;其他试剂均为国产分析纯。1.1.3u3000材料LRH-150-MS霉菌培养箱:韶关市明天环保仪器有限公司;YX-280D不锈钢手提式高压灭菌锅:合肥华泰医疗设备有限公司;CR-22G型高速冷冻离心机:日本HITACHI;UV2300紫外-可见分光光度计:上海天美科学仪器有限公司;SevenEasypH计:瑞士MettlerToledo;H.S.GIO-2电热恒温水浴锅:浙江临海市东方仪器厂。1.2实验方法1.2.1产酶发酵培养基将4℃保存的斜面菌种转接到PDA培养基上,28℃培养3d,制作孢子悬浮液。产酶发酵培养基由麸皮和蒸馏水按1∶1组成。接种1mL孢子悬浮液于已灭菌培养基的250mL锥形瓶中,28℃培养48h。1.2.2水、阿利克氏培养结束后,每个锥形瓶中加入100mL无菌去离子水,于4℃过夜。提取液用4层纱布过滤,离心(4℃、4020×g、10min)后得到的上清液即为粗酶液,4℃透析粗酶液24h,测定时经缓冲液稀释适当倍数。1.3羧酶活性测定1.3.1酶反应定量移取1.8mL底物(Z-Phe-Leu,2.0mmol/L)溶液于5mL离心管中,再加入酶液0.2mL,37℃保温6h。1.3.2亮氨酸样品的制备亮氨酸标准曲线的制作:精确配制2.0mmol/L的L-亮氨酸标准溶液。取16支试管,分为2个平行组,用蒸馏水稀释得一系列浓度0mmol/L~150.0mmol/L的亮氨酸溶液1.0mL,加入2.0mL镉-茚三酮试剂,84℃水浴加热5min,冷却至室温,测定波长507nm处的吸光度值。从酶底物反应液中量取50μL,再加入950μL蒸馏水,得到1.0mL的稀释后样品,按照标准曲线方法测定。产物浓度通过标准曲线计算。酶活定义为在pH7.0、温度37℃条件下,每小时每毫升粗酶液使底物分解产生的亮氨酸的微摩尔数,μmol/(mL·h)。2结果与讨论2.1土壤有机溶剂最佳ph值及酶活力配制一系列pH值为3.5~11.0的缓冲液,以0.5单位为梯度,pH3.5~6.0(Na2HPO4-柠檬酸),pH6.5~7.5(K2HPO4-KH2PO4),pH8.0~9.0(Tris-HCl),pH9.5~10.0(Na2B4O7-NaOH),pH10.5~11.0(NaHCO3-NaOH)。缓冲液适当稀释酶液,并制备相应pH值的底物溶液。以最高的酶活力为100%计算相对酶活,结果见图1。由图1可以看出,酶液在pH5.0~9.5都具有羧肽酶活力,而且酸性、中性和碱性范围内都有酶活峰出现,最大酶活峰出现在5.5<pH值<7.5,说明放射毛霉羧肽酶是以中性偏酸性羧肽酶为主的复合酶系。羧肽酶最适pH值为6.0~7.2,羧肽酶的最适pH值为6.6。表明放射毛霉羧肽酶作用的pH值范围较宽。而且,测定酶活应在近中性环境,因为强酸或强碱环境都不利于放射毛霉发挥羧肽酶的外切作用。2.2ph值对羧肽酶稳定性的影响用不同pH值缓冲液分别将酶液稀释5倍,4℃放置24h后进行酶活测定,以T=0时的酶活为100%计算残留酶活,结果见图2。图2结果表明,在pH值为3.5~6.5时,羧肽酶的稳定性随着pH值的改变波动较大,pH值>6.5时,稳定性缓慢增强。除pH值为5.0和pH值为6.5时,羧肽酶在pH3.5~11.0缓冲液中4℃放置24h,残留酶活都在70%以上。因此,除pH值为5.0和pH值为6.5时,放射毛霉羧肽酶在整个pH值范围内都具有良好的稳定性。2.3酶的测定结果将透析后酶液用20.0mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)稀释5倍,底物Z-Phe-Leu用相同缓冲液溶解至终浓度为2.0mmol/L,酶和底物在不同的温度(30℃~70℃,以5℃为梯度)进行酶活测定,结果见图3。图3结果表明,放射毛霉羧肽酶的最适作用温度为40℃,当温度在30℃~40℃之间时,羧肽酶活力随着温度升高而逐渐增强;在较宽的温度范围内(40℃~45℃)都能保持较高活力。当温度高于45℃,羧肽酶活力随着温度升高迅速减弱。2.4保温时间对羧肽酶相对酶活的影响将稀释后的酶液在不同温度水浴加热3h,每30min取样1次,样品迅速放置在冰水浴中降温,然后恢复至室温并进行酶活测定,结果见图4。图4结果表明,酶液在30℃、35℃、40℃保温3h后,残留的羧肽酶相对酶活均在70%以上,说明放射毛霉羧肽酶在30℃~40℃时具有良好的稳定性;在45℃条件下,随着保温时间的延长,酶液残留酶活迅速下降;当温度≥50℃、保温30min时,残留的羧肽酶相对酶活随着温度的升高迅速下降。这说明加热温度对羧肽酶的影响远大于加热时间的影响。同时说明放射毛霉羧肽酶不是一种耐高温酶类。2.5残留酶活与酶活比的关系将含有Zn2+、Mn2+、Ca2+、Hg2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Ba2+、Ni+、Li+、K+、Na+、NH4+的盐溶液加入酶液中,37℃保温1h后进行酶活测定(金属离子在溶液中的浓度为0.99mmol/L和9.1mmol/L)。以相同条件下不含金属离子样品的酶活为100%计算残留酶活。图5结果表明,Mg2+、和NH4+都能促进羧肽酶活力,其中卤化物形式的Mg2+(0.99mmol/L)促进作用最显著,相对酶活达137%,硫酸盐形式Mg2+促进作用次之;Cu2+、Fe2+、Fe3+、Ni+、Hg2+对羧肽酶活力表现出强烈抑制作用,残留酶活约10%;Zn2+、Ca2+、Mn2+、Co2+对羧肽酶有一定程度的抑制作用;而Ba2+、Li+、K+和Na+对羧肽酶影响不明显。2.6金属离子对羧肽酶的活性影响向酶液中分别加入乙二胺四乙酸(EDTA)、1,10-邻菲啰啉(OP)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二异丙基磷酰氟(DFP)、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、对氯汞苯甲酸(PCMB)、碘乙酸至终浓度分别为0.99mmol/L和9.1mmol/L,37℃保温1h后进行酶活测定,以相同条件处理且不含金属离子的酶液酶活为100%计算残留酶活。结果见附表。化学修饰实验结果(附表)表明,金属蛋白酶的抑制剂中,弱抑制剂EDTA对羧肽酶酶活抑制作用较弱,而强抑制剂1,10-邻菲啰啉在低浓度水平(0.99mmol/L)即可抑制70%的酶活;丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、DFP对羧肽酶有强抑制作用;巯基抑制剂PCMB、DTT、碘乙酸和β-巯基乙醇对羧肽酶活性也有一定的抑制作用。表明羧肽酶活性中心含有丝氨酸残基和二硫键结构,能被金属离子Mg2+激活。这一结果类似于嗜热芽孢杆菌高温蛋白酶HS08的活性结构特点。3最适条件探讨2羧肽酶活力3.1麸皮培养基固态发酵雅致放射毛霉菌株Actinomucorelegans3.2778得到羧肽酶粗酶液,对底物肽N-CBZ-Phe-Leu具有羧肽酶活性。3.2羧肽酶最适作用pH值为6.0~7.2,最适作用pH值为6.6;最适作用温度为40℃~