现代生物技术进展答案

激光共聚焦扫描显微镜有什么特点？1光源：用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。2共聚焦技术：在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住。3点扫描技术：共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。也就是通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，将一个连续的光切图象ZZ轴重叠就可形成一个完整的三维图象普通光镜：是在可见光源下一次性成像。4信号放大、电子图像：光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。5软件：计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。优势：在结构方面：激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高，可实现分层扫描，可实现连续扫描，可动态记录变化，可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像，扫描速度快，对样品损伤小。在效果方面：更灵敏：共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。定位更精确：不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。定量测量。静态的定量测量：对于不同组的样品，可以单纯比较一种成分，也可以同时比较两种甚至三种成分。也可以在同一张切片上比较不同成分含量。动态的定量测量：共聚焦显微镜还能对活细胞内的特定成分（如：钙、钠、氢等）进行动态变化测量，并给出动态变化曲线；还可以同时测量几种成分，并给出含量比值。快速性：由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。数据图像可及时输出或长期储存：用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是数字化的，不存在暴光方面及胶卷冲洗方面的问题（如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光淬灭等）；而且图像可进一步加工处理。与静态细胞观察相比，活细胞观察有哪些优势？活细胞动态观察静态成像科研角度能够连续观察细胞及分子水平的动态变化，阐明机制，更能说明问题需要大量样品、时间点，样品的差异化问题，出现假阳性结果应用范围既能满足高分辨，又能够满足实践分辨要求较高的实验无法做时间分辨比较高的实验，以及对细胞或分子实时动态三维观察实验过程实验简单化，操作步骤少，数据信息充足实验设计复杂，步骤多，数据信息少绿色荧光蛋白如何发出绿色荧光？水母体中有一种发光蛋白Aequorin，它与钙离子结合时会发出蓝光，这道蓝光立刻被一种蛋白吸收从而发出绿色荧光，这种捕获蓝光、发出绿光的蛋白质就是GFP。GFP生色团：Ser65--Tyr66--Gly67，GFP中丝氨酸65展开多肽骨架环化形成咪唑啉酮环系统形成通过脱氢反应-H2O形成环化环系统在经过氧化反应+O2形成成熟绿色荧光发色基团，发绿色荧光。荧光的发光是被一定波长光激发后，电子被激发到高能级，随后向低能级跃迁的过程中发出比激发光波长更长的荧光，这也就是上面提到的受激辐射。我们将能接受光辐射，并跃迁发出颜色光的基团叫做生色团。绿色荧光蛋白含有一个三肽的单位Ser（65）-Tyr（66）-Gly（67），在蛋白质折叠的时候，这三个氨基酸会折叠成5元环的咪唑酮的结构，也就是生色团。当它被激发后，失去一个质子，形成了带负电荷的结构，在这种构象下就可以发光了。与传统的荧光素相比，绿色荧光蛋白应用于蛋白质的荧光标记时有哪些优缺点？与荧光素酶相比，绿色荧光蛋白作为报告基因有哪些优缺点？举例说明绿色荧光蛋白可以应用于哪些方面？报告基因：可以监控细胞内活动；可以进行细胞筛选（FACS）：例如，可以在胚胎或成体复杂的组织中分离得到表达荧光蛋白的活细胞，通过荧光激活细胞分选，我们可以通过解剖分离含有目的的荧光蛋白的组织，然后酶消化成单个细胞，流式分选出表达目的的荧光蛋白的活细胞；还可用作蛋白质定位，如果蛋白质进入则颜色会叠加；可用来观测基因的表达水平。转基因动物：主要是GFP在肿瘤研究中的应用，例如可以通过荧光的强弱判断肿瘤的大小与深度，内部的肿瘤所发出的荧光由于受周围组织，尤其是皮肤的干扰，小的瘤灶常难以显示，因此我们可以在欲检测的器官做一个可逆性的皮瓣，观察时打开皮瓣，建立荧光通路。传感器：检测细内PH，绿色荧光蛋白可以激活FP，转换FP，开关FP。光漂白恢复：光漂白（photobleaching）指在光的照射下荧光物质所激发出来的荧光强度随着时间推移逐步减弱乃至消失的现象。借助于高强度激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光淬灭（即漂白），该区域周围的非淬灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度激光扫描探测，因而可得到活细胞的动力学参数。为什么说“蛋白质药物开发是独一无二的挑战”？蛋白质分子与小分子物质稳定性比较蛋白质小分子大量潜在的反应位点很少反应位点大量离子化位点很少离子化位点有二级、三级、四级高级结构没有高级结构温度效应是间断的（变性）温度效应是连续的易支撑微生物生长常用的包涵体复性方法有哪些？有何优缺点？常用方法：稀释法，透析法，超滤法，液相色谱法优点：复性条件比较温和、层析介质的隔离降低了蛋白相互作用产生的聚集；可同时实现蛋白质的复兴和纯化，耗时少；回收率高、快速、易放大、样品稀释倍数小（一般5倍左右）缺点：很难避免在交换溶液时变性蛋白聚体形成少量沉淀，并且吸附在凝胶介质，造成复性率和柱子载样量降低药用重组蛋白生产过程中需要检测哪些项目？要使用哪些方法来检测？检测项目检测方法产品是否含内毒素家兔热原法蛋白质是否变异肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳甲硫氨酸是否被甲酰化肽谱、质谱、HPLC、Edman分析基于口服蛋白质的新的治疗和成像策略的开发提供了新的见解和坚实的基础，使用简单易行的技术。归纳整理出案例“Preparationofchitosan-basedmultifunctionalnanocarriersovercomingmultiplebarriersfororaldeliveryofinsulin”中纳米颗粒的设计方案，各组分的作用是什么？作者如何验证纳米颗粒的效果?题目：基于多功能纳米载体克服多重障碍的口服胰岛素壳聚糖的制备各组分作用：壳聚糖与聚阴离子的相互作用导致在水性介质中和温和条件下自发形成纳米颗粒，不需要使用有机溶剂或加热，避免细胞毒性问题和对胰岛素稳定性的威胁。LV，L-缬氨酸，用作促进小肠吸收的靶配体PBA，L-缬氨酸修饰的壳聚糖在纳米粒子中对蛋白质药物的包封率高，药物吸收增强，药物在肠道中滞留时间延长以及有利的酶促抑制作用等都有很大的贡献。L-缬氨酸结合的药物增强了药物的口服生物利用度，L-缬氨酸结合的载体在吸收药物中的巨大潜力。苯基硼酸，疏水和葡萄糖敏感单元，从合成组分中引入替代的葡萄糖传感器部分苯基硼酸作为这样的目标的潜在候选者，这是由于硼酸可逆地与二醇结合形成环状硼酸酯在水介质中如何验证：通过壳聚糖的接枝反应合成多功能纳米载体。为了设计具有目标特异性的系统，将L-缬氨酸引入纳米载体，其通过受体介导的内吞作用促进其递送。由于胰岛素和PBA之间的疏水反应以及胰岛素和壳聚糖之间的静电反应，胰岛素可以被装载到纳米碳管中。在含有胃蛋白酶的模拟胃液（SGF）和含有胰酶的模拟肠液（SIF）的存在下分别建立负载胰岛素抵抗消化酶的化学稳定性。共聚焦激光扫描显微镜观察HT-29细胞的摄取行为。口服给糖尿病大鼠后，与皮下注射胰岛素相比，获得了有效的降血糖作用。这项工作表明，L-缬氨酸改性壳聚糖基多功能纳米载体可能是口服胰岛素的有前途的药物递送载体。为了克服口服递送胰岛素的多重障碍，将L-缬氨酸（LV，用作促进小肠吸收的靶配体）和苯基硼酸（PBA，用作葡萄糖响应性的）的基于壳聚糖的多功能纳米载体单位）已被设计和评估在这项研究中。得到的纳米载体对HT-29细胞显示低的细胞毒性，并且对蛋白质溶液具有优异的稳定性。通过pH和葡萄糖体外评估胰岛素释放行为。在含有胃蛋白酶的模拟胃液（S