第10章 富含多不饱和脂肪酸的光合微生物的调查 姜剑锋

#W.H.ChartsiRtheMolecularSpeciesDistribution(<44(TFA)a^dContent(M9eL'JtnMGMof#?fndiatFell网4n勺我MOwryfr^FnN-Slorvation'.MolecularSpecr-MMflltCuliir5pcc.it-5-DistributionsndConrent*4-StarvationRtt<i¥try%TFAP旳L%IFApq/nfLCWC16132/16:2?l.35.02.610;30-3^1氐2碗2启4.9ISlB2/16!3n-i12.52.Q4.31„1ie；J/1C;Jn-32423.925A7.7Total?曲阳B3.913437.1N3cwcia牯叮打E12trEr3.BIJlS2fl8dz.oO.i6.41.905trtr时1馭HMeTLltL)2A0J&13022.40l?liouiiByit6,11.0IM4,7czo/cia用F8d2.fl0J10.)3.14Bfla?iu*2曲/1的n-32.10l37J22TM2CU20■卅1,41U1UC2fl/catj却豁煜CM1J00.1知2JB'Cultiu'cs□<P,inrrsflvwerekeptanN-freemetihjmforUd.Culuireiweneretuipenc^iTinfullnirfiunijiri活r血问edfaranother2dat2fl'CKJFAareafIhrfamily,ufile^ci[l-i*-rwit?n-otrd.PositionalD-na^shwa^naipMformsd.Abbrevialions!totalfattyactdilFA!traceyt.Sour轉Kttfliin-GoloWrr^etal..?M5.这些发现支持了我们的假说，即雪藻中富含花生四烯酸的甘油三酯的一个重要作用就是构建富含多不饱和脂肪酸的叶绿体膜，尤其是在低温时，多不饱和脂肪酸的从头生物合成太慢的条件下。的确，最近人们建议，脂质体的亚细胞作用比上述假设要复杂得多，它们相对无效的碳储存方式。这就促使我们要对极性油脂进行改造。在一些绿色藻类和高等植物中，叶绿体脂质被分为两类：原核脂类和真核脂类。在原核脂类中甘油骨架sn-2位上是C16脂肪酸，记为18/16；而在真核脂类中，两个位置都是C18脂肪酸，记为18/18。我们的发现表明，在雪藻中，叶绿体油脂的产生有两种途径：第一种途径是原核途径，与16:3植物和少数几种绿色藻类类似，生产出18/16类型的分子，也就是单半乳糖甘油二脂（或许还有其它的叶绿体脂类）。另一种途径是原核途径，生产出三种类型的分子，分别是18/18、20/18和20/20，这些分子类型看来是从1，2-二酰基甘油-0-4'-（N,N,N-三甲基）高丝氨酸和卵磷脂，还有甘油三酯衍生来的（图10.5）。■»■=*834»Fi乎10J.冃*卍■»■=*834»Fi乎10J.冃*卍itMJtiMof闭对如yinchlnroplwticbpidi[leftscatejafldTAG(rightralrlqrfP吐沁Inthelkst48h问碍in自hiir^n刖环朗如fw皿4Irtwlingwirth[1」^lia：!fm出handniwqpfl足plefikshmerrtat河*C(Irfi冏门前呵I2TBghr(Hr>eO：TAG(EkMGDG(II.DGDG(A!-,andSCJDGl+An^specEivel/.―hcm?—*—8s)tKSTltnt(hEMiriaJlrO^・rtl>JeGhhrfiiEB4J■F4CDG*—DGEXi―*—SQM：TtatvtIhMrt«flfflillTne™FEpJEttiihaiEHrfli我们随之对构建叶绿体脂质的几种方法进行了试验。发现，当环境条件不利于藻体生长的时候，例如，在稳定期或者氮缺乏时，原核途径占优势，包含了超过70%的单半乳糖甘油二脂，产生出诸如18:2n-6/16:2n-3的分子类型。在通常情况下，真核途径（真核途径I）占优势，而且两种途径的n-3去饱和途径都会加强，通过原核途径和真核途径分别产生出18:3n-3/16:3n-3和18:3n-3/18:3n-3的分子类型。当培养的过程中突然要求我们要加强去饱和途径的时候，例如在最佳温度条件下从缺氮培养中恢复过来的是时候，利用1，2-二酰基甘油-O-4'-（N,N,N-三甲基）高丝氨酸和卵磷脂从头合成并不能满足需要。因为藻体的生长条件可能是瞬变的，甘油三酯能迅速的释放富含花生四烯酸的酰基部分，并被输送到叶绿体中生产20:4/20:4的分子类型（真核途径II）（表10.H）。花生四烯酸基部分的输入只是短暂的，在最佳条件下生长几天后,叶绿体花生四烯酸就会减少到正常水平，而原核分子类型也会恢复它的优势地位。

CytQpl師cn\7D|g：3n-3一IS:3n-3Enl<iNoroplastn-fcDji-6D»JpeiTD初1(L2,口ullw白Ih«b«tvn4hr^d[hrwrlriiCytQpl師cn\7D|g：3n-3一IS:3n-3Enl<iNoroplastn-fcDji-6D»JpeiTD初1(L2,口ullw白Ih«b«tvn4hr^d[hrwrlrii」、吟卅叫：WhmHul.iriprri^^ofMGlXt■■P.irirrnLhil^ri^nllwfwiwPLJfAn曲Ml*h#・ihIzinlR,DOTSPCTAG^—16：IIM<ibL51LKTFjuksiryoticIIhflriri-3pmkitrytrticEiakuT^ntic另外一种藻类——紫球藻的研究结果也相类似。当紫球藻的生态环境突然变化的时候,真核分子类型的单半乳糖甘油二脂含量由30°C时的42%增加到20°C时的58%；并且，伴随着氮的补充，通过甘油三酯中花生四烯酸的输入，产生了20/20分子类型的单半乳糖甘油二脂。最近,高等植物的脂质体被证明在种子和其它植物器官中具有代谢活性。Stobart等人证明，在发育的红花种子中，微粒体膜上存在着一个甘油三酯的酰基转移机制。暴露在强光中会损害光合机制，尤其是在低温条件下，损害的主要地方是光合系统II的D1蛋白质。脂肪酸的去饱和作用对忍受强光非常重要，尤其在低温时，低温会导致D1蛋白质的加速合成。雪藻的最佳生长温度是25°C，但是从日本分离的一个藻株能经受4C的低温。通过测量氧气的演化和可调的荧光，我们发现雪藻Pincisa比紫球藻对低温共有抵抗力，它的低温耐受性几乎和极地雪藻Chlamydomonasnivalis一样高。双高-Y-亚麻酸产品双高-Y-亚麻酸是人体许多重要具有生理活性物质（如前列腺素、白细胞三烯）的前体，它还具有重要的药理学意义。但是目前，我们还缺乏双高-Y-亚麻酸来源和应用上的研究。与其它多不饱和脂肪酸可以在高等植物、真菌和藻类积累不同，双高-Y-亚麻酸仅仅是花生四烯酸生物合成的中间体，它在任何生物体中都不存在。并且,在人体内，从Y-亚麻酸到双高-Y-亚麻酸的转换只有在特定情况下才会出现，如低钙时，并且这种转换非常少，在这种情况下，我们不能认同Y-亚麻酸就和双高-Y-亚麻酸一样。唯一报道过的双高-Y-亚麻酸的来源是被抱霉菌。雪藻中高含量的花生四烯酸提示我们，这个有机体也可以用来生产其它多不饱和脂肪酸。因此，我们利用N-甲基-N'肖基-N-亚硝基胍来对雪藻进行诱变。因为花生四烯酸的一个作用就是在低温下为细胞膜提供一个高水平的不饱和状态，因此，我们选择突变株的一个重要原则就是在这些条件（低温）下，那些欠缺这种转换能力的突变株。事实上，在这些突变株中，P127在去饱和途径上有缺陷，它几乎不能将双高-Y-亚麻酸转化为花生四烯酸。这个突变株的发现是因为基因上一个终止密码子的出现，使得这种转化酶的功能丧失。诱变株产生很少量的花生四烯酸和高含量的双高-Y-亚麻酸，占到总脂肪酸含量的39%以上（表10.I），占细胞干重的14%，这就使之成为生产双高-Y-亚麻酸的潜在菌种。诱变株中油脂的分配和野生株基本相同，但是脂肪酸组成有着明显的差别。诱变株的脂类主要包括卵磷脂、脑磷脂、1，2-二酰基甘油-0-4'-（N,N,N-三甲基）高丝氨酸和花生四烯酸转化而来的双高-Y-亚麻酸。然而，在叶绿体脂类和甘油三酯中，诱变株的双高-Y-亚麻酸含量比野生株中对应的花生四烯酸含量低得多，在甘油三酯中，双高-Y-亚麻酸的含量是27%，但在野生株中，花生四烯酸的含量为54%,另一方面，18:1却由野生株的20%增加到43%。在单半乳糖甘油二脂（MGDG）和双半乳糖甘油二脂（DGDG）两种半乳糖脂中，双高-丫-亚麻酸的减少是由n-3去饱和途径的加强导致的，并最终导致16:3和18:3含量的增加。实际上，诱变株的单半乳糖甘油二脂和双半乳糖甘油二脂主要由原核的18/16和真核的18/18分子种类组成，这就使n-3去饱和途径的脂肪酸占优势。TiN-o汕!■MMwFray咸LlpdCUms亦wikilypc(>VT?*fMiMbUM汩12j*l41flmLi'riRAiwij、dnFNHringfnii.niFl申n.Upd.Sin^nFwfvJwldbiQdQ1iK2n-3lttrl£JI9Jn-ijoj-rrfn-6M3PGWT32血1.?g3iu11«PUT32L?砒uW*4A_Wl1*9U}lQ&J却l.k血[U21出152ID50M-3U251TPC.最a2IJ>11TtA44出日P12T1?Q•沁g■HJ&月2fSlIZUO和QB1.034119122I2j4UH任WTdJ(14PUT11.1阳dJ24.1414■1*^wtTT述1菌H.7□J1.1540Pijr■123DlBffibiri-T.iwfrrh才存片耳伽u^bRsn^d我们推测，野生株叶绿体脂类的双高-Y-亚麻酸和不饱和脂肪酸的减少是由原核和真核类型1的分子种类的增加和n-3去饱和途径的加强导致的。所以，低温下，突变株的生长能力比野生株的低。双高-Y-亚麻酸的生产率野生株中，双高-Y-亚麻酸的含量比野生株中花生四烯酸少，而C18(主要是18:1和18:2)脂肪酸的比例则出现增加。这尤其重要，因为这两种脂肪酸通常会损害双高-Y-亚麻酸，而自身在甘油三酯中积累。这就要求我们要仔细衡量环境条件对双高-Y-亚麻酸含量和C18/双高-Y-亚麻酸比率的影响。氮缺乏会导致总脂肪酸和双高-Y-亚麻酸含量的增加，而磷酸盐缺乏会导致一些脂肪酸含量的增加和双高-Y-亚麻酸含量的减少。另一方面，增加十倍浓度的磷促进了生物量的增加和双高-Y-亚麻酸含量的增加，并且，还会导致C18/双高-Y-亚麻酸比率的下降。缓冲剂的加入减弱了pH的影响，并使脂肪酸含量由34%增加到42%,双高-Y-亚麻酸的比例也由28%增加到35%,总双高-Y-亚麻酸含量由10%增加到15%。并且，18:1和18:2的比例明显的下降，(18:1+18:2)/双高-Y-亚麻酸的比率更是由1.35下降到0.96。ntaN14U.EttKQf-RWGphM*CtMfiWHiMTmJ阳即站CMjL>l|口才亡皿C&rcrtiCWDGIA矗TWETT和R1昨11«Z?.9useJ3—1SJMJJU1Z«47?Ml-』l5地，449扳fuhi»iftB&M14JjrOihJjmh*苗1|.DuM7£mM口乩er”吶iriffl讯自b阿w讯tk/^<N弟血MnWTriPHCL軒拦*叭日即DGl丄川血I■刚［中if0<yCW.dk^屯nyKkKTHLithrdt:Q^hlhfa<（hiiiiii-Cc4ifcrn^Kip^j^nh^在氮限制阶段，我们研究了不同的初始氮含量的影响。发现，但培养进行到无氮培养阶段，18:1上升得非常明显，而对双高-Y-亚麻酸则有损害。然而，当初始氮含量只有50%或25%（相对于BG11培养基）的时候，（18:1+18:2）/双高-丫-亚麻酸的比率则有所改善（下降），归因于生物量的积累，此时的双高-Y-亚麻酸的含量也高一些。光照强度和生物量影响到每个细胞所受到的的光的大小。高的生物量和低光照强度（35yE/m2s）导致双高-Y-亚麻酸含量的增加（占40%左右），然而，油脂总产量和双高-丫-亚麻酸的总产量基本不变。在1升的一个反应柱中，在氮缺乏和180yE/m2s的光照条件下，结果14天的培养，达到最大的双高-Y-亚麻酸含量（占干重的10%），生物量为1g/L。而在相似的氮缺乏和450pE/m2s的光照条件下，达到最高的双高-Y-亚麻酸产量（755mg/L），此时的生物量为2g/L。我们期待着更高的生物量和营养状况的出现，并使双高-Y-亚麻酸的含量和产量达到更高。结论按照目前流行的说法，植物积累甘油三酯来贮存能量。实际上，大多数藻类的甘油三酯大多数由饱和和单不饱和脂肪酸组成，这些脂肪酸能相对简单的提供更多的能量。我们在对红藻门的紫球藻（Porphyridiumcruent）进行研究时发现，甘油三酯上结合的长链多不饱和脂肪酸能被用来生物合成