第5次课-天然产物研究实验室技术3(结构鉴定)-PPT幻灯片

一、化合物的纯度测定

1.检查晶形

2.测定熔点

3.TLC或PPC检查：一般需要三种系统，且需用通用显色剂显色（如硫酸、磷钼酸等）。

4.GC或HPLC二、结构研究的主要程序已知化合物：与标准品对照：共薄层（三种以上系统）：Rf值相同共熔点共红外无标准品：与文献数据对照mp,IR,UV,MS,1HNMR,13CNMR未知化合物确定分子式、分子量：元素分析、质谱、1HNMR、13CNMR谱功能基、基本骨架和结构式确定：

1、定性反应2、反应薄层

3、化学反应3、波谱法4.不饱和度的计算：

C25H30O15CnHmOvu=25-30/2+0/2+1=11225+2-30u==112天然产物结构鉴定主要波谱方法：

紫外光谱

红外光谱

质谱

核磁共振谱

旋光谱圆二色谱

X-射线衍射一、紫外光谱（UV,Ultra-VioletSpectrometry）原理：有机分子吸收紫外光（200-500nm）后产生电子振动而形成的吸收光谱。应用：主要用于测定分子内的共轭系统。1、饱和烃：无紫外吸收2、不饱和脂肪烃：孤立双键：200nm共轭双键：＞200nm3、芳环：取代苯环＞200nm

黄酮类化合物386MeONa200300400500268333MeOH二、红外光谱（IR,Infra-redSpectrometry）原理：有机分子吸收红外光（500~4000cm-1）后产生化学键振动而形成的吸收光谱。作用：功能基的确定，如羰基、双键、芳环等应用：未知物鉴别、化学结构确定化学反应检查、区别异构体纯度检查、质量控制环境污染监测等消旋山莨菪碱OHAromaticringC=O特征区：4000~1250cm-1

特征峰疏，易辨认

确定功能基团＞3000cm-1OH、NH2、COOH~2900cm-1C-H伸缩振动1900-1650cm-1C=O伸缩振动1690-1600cm-1C=C伸缩振动1000-650cm-1C-H弯曲振动烯或芳环取代情况指纹区：1250~400cm-1

吸收峰密集，结构微小变化敏感区别两个化合物是否相同三、质谱（MS,MassSpectrometry）原理：样品在质谱仪中生成阳离子，在稳定磁场中按质核比（m/z）顺序进行分离，通过检测器纪录下来。质谱法可以给出化合物的分子量，根据裂解碎片可以推断化合物的结构。用途：元素分析，分子量测定，分子式确定，糖、苷分子中单糖的连接顺序。质谱的种类：1.EI-MS：电子轰击质谱Electronimpactionization2.CI-MS：化学电离质谱Chemicalionization3.FI-MS：场致电离质谱Fieldionization4.FD-MS：场解析电离质谱Fielddesorptionionization5.FAB-MS：快速原子轰击电离质谱

Fastatombombardmentionization6.ESI-MS：电喷雾电离质谱Electrosprayionization7.MALDI-MS：基质辅助激光解析电离质谱8.API-MS：大气压电离质谱电子轰击质谱（EI-MS）

electronimpactionization

样品经高温（300C）气化，气态分子受一定能量的电子冲击而电离和裂解产生各种阳离子。分子离子峰；碎片峰。应用：苷元、易气化的小分子EI-MSM+2.场解析质谱（FD-MS）原理：样品不经气化与载体表面形成薄膜，在强电场作用下电离为阳离子。应用：难挥发，热不稳定的糖、肽等3.快原子轰击质谱（FAB-MS）原理：样品与甘油混合由载体引入，分子经快速原子氩轰击后进入质谱仪。应用：高分子、热不稳定、强极性的糖、肽等[M]+M-rhaM-rha-glcM-rha-rha-glcM-rha-rha苷元FAB-MS[M+1]+四、核磁共振谱（NMR,NuclearMagneticResonance）常用氘代溶剂杂质峰及水峰1.1HNMR通过化学位移（δ），积分曲线高度以及裂分情况可以判断分子中1H的类型，数目及相邻原子或原子团的情况，对有机化合物的结构测定具有重要的意义。（1）化学位移：不同类型的1H核磁共振信号将出现在不同的区域，据此可以进行识别。

类型δ，ppmCH－C－CH30.8~1.2－C－CH2P1~1.5－C－CH1.2~1.8R－CH(α)－CH(β)α-H:+2~4(R=OH,OCOR,OR,NO2,X)β-H:+1~2R－CH(α)－CH(β)α-H:+1~2(R=C=O,C=C,Ar－)β-H:+0.5~1≡CH2~3=CH5~8Ar－H6~9－CHO9~10活泼氢（OH,SH,NH)不定，加入D2O后消失（2）峰面积：氢的数目（3）信号的裂分:偶合常数（J）

s（singlet，单峰）

d（doublet，二重峰）

t（triplet，三重峰）

q（quartet，四重峰）

m（multiplet，多重峰）信号的裂分符合n+1规律2.核磁共振碳谱（13C-NMR）13C信号的裂分：符合n+1规律q（CH3）、t（CH2）、d（CH）、s（-C-）。基团

C(ppm)基团

C(ppm)CH3-伯碳0~30Ar(芳环)110~135CH3-O-40~60Ar-y(取代芳环)123~145-CH2-O-40~70-COOR（酯）155~175

CH-O-60~76-CONHR(酰胺)158~180

CH-(叔碳)31~60-COOH158~185

C

(季碳)36~70-CHO175~205-C

C-70~100

、

-不饱和醛175~196

C=C

110~150

、

-不饱和酮180~213常见13C-NMR谱类型及其特征：①噪音去偶谱（protonnoisedecouplingspectrum），全去偶（protoncompletedecoupling,COM）或宽带去偶（broadbanddecoupling,BBD）。特点：所有C信号均作为单峰出现照射1H核，将产生NOE效应从而使观测核的信号强度增强，DEPT就是通过极化转移检测增强的13C信号。DEPT通过改变对1H核的第3个脉冲宽度（

），使设定分别为45

、90

和135

来区别碳原子的种类，分别得到只有甲基（CH3）、亚甲基（CH2）和次甲基（CH）信号的图谱。②DEPT(distortionlessenhancementbypolarizationtransfer)：3.二维核磁共振（2D-NMR）1H-1HCOSY13C-1HCOSY，HMQC

远程13C-1HCOSY，HMBCNOESYTOCSY同一自旋偶合体系里质子之间的偶合相关，对角线上出现的是一维1H-NMR的投影，对角线以外信号称为交叉峰或相关信号，处于两个轴上质子信号的水平和垂直连线的交叉点上，表明对应的质子间相互自旋偶合。（1）1H-1HCOSY（correlationspectroscopy23（2）13C-1H

COSY相关

C-HCOSY

HMQC：异核多量子相干谱（heteronuclearmultiplequantumcoherence）直接键连的C-H间的偶合相关，一般谱图中X轴为13C化学位移，Y轴为1H化学位移，交叉峰出现在相应的13C和1H信号的垂直和水平连线的交叉点上。

13C-1HCOSY检测13CHMQC（HSQC）检测1H（3）远程C-H相关远程13C-1H相关（LongRange1H-13CCOSY）

HMBC：异核多键相干谱（Heteronuclear

MultipleBondConnectivity）

提供两键或大于两键，主要是三键的C-H偶合信息，抑制了直接偶合信息（1JCH），建立C-C间的关联，甚至越过氧、氮或其他原子的官能团间的关联，特别解决由于屏蔽效应难以解释的季碳归属问题。（4）NOESY（NuclearOverhauserEffectSpectroscopy）检测质子之间通过空间的偶极相互作用（即NOE），可以建立核与核（相距不超过2.5Å）通过空间的连接关系以及原子在空间的位置关系，也可以提供有关分子的立体化学的信息。NOESY：two-dimensionalnuclearOverhausereffectcorrelationspectroscopy,二维核欧沃豪斯效应谱NOESYspectrumGlc-13-OMe7-OMeH-2H-4H-8H-5利用NOE技术确定C-12和C-20构型C-12(S)和C-12(R)：IR、MS、1HNMR、13CNMR几乎一样Neo-clerodan-20,12-olideneo-clerodane-lactoneC-20,C-12hemiacetalicfunction12(S)H-

12(R)H-***照射17-CH312(S)H-14

H-1612(R)H-12

12**20(S)同侧17-CH3H-2020(R)异侧17-CH3H-20（5）TOCSY（totalcorrelationspectroscopy）接力相干转移和多重接力相干转移激发磁化相关作用沿着偶合链传播，得到该质子与偶合链中其他质子的相关关系，也称为2D-HOHAHA谱。TOCSY对解析具有多个偶合链、信号重叠严重的复杂分子非常有用，特别是多糖苷。只要从一个偶合链中选择一个分辨良好、不与其他质子信号重叠的信号开始，就可以解析该偶合链中的所有质子信号。甾体皂苷的2D-TOCSY谱

甾体皂苷的1DTOCSY谱五、旋光光谱（Opticalrotatorydispersion,ORD)用不同波长的偏振光照射光学活性化合物，并用波长对比旋[]10-2或分子比旋[]10-2作图,得到的曲线即为旋光光谱。种类：平坦曲线：无峰谷之分结构中有不对称C，但在200-700nm无紫外吸收。

正性谱线负性谱线123正性Cotton效应谱线：峰在长波部分；谷在短波部分。负性Cotton效应谱线：峰在短波部分；谷在长波部分。单纯Cotton效应谱线：ORD中只有一个峰和谷。5-胆甾烷-3酮（4）5-胆甾烷-3酮（5）复合Cotton效应谱线：ORD谱中出现两个或更多峰与谷。旋光谱意义：确定非对称结构的构型和构象。方法：找出ORD谱的谱形和cotton效应与构型、构象之间的关联，并用立体结构尽可能相似或相反的已知化合物与未知化合物的ORD谱比较，以确定未知化合物的立体结构。5-胆甾烷-3酮（4）5-胆甾烷-3酮（5）谱线与5相似六、圆二色谱（CircularDichroism,CD）平面偏振光可以分解为两个周期和振幅相同，方向相反（左、右）的圆偏振光。在具有旋光性的物体中，由于左旋和右旋圆偏振光的传播速度不同，导致了平面偏振光平面的旋转。当平面偏振光在一个旋光性的物体中传播时，除了两个圆偏振光的速度不同外，这两个圆偏振光被吸收的程度也不相等，称为圆二色性(CircularDichroism)。如果在一定的波长范围内（200~700nm），用左旋和右旋圆偏振光的吸收系数差

或摩尔椭圆度[

]的连续变化对波长作图，得到该有机化合物的圆二色谱(CD谱)，呈现峰的为正性圆二色谱，出现谷的为负性圆二色谱。谱线的正性和负性，旋光谱和圆二色谱是一致的。CD谱应用：研究手性小分子天然药物以及大分子糖类、多肽、蛋白质、核酸等的立体结构。利用CD谱确定单萜和木脂素的绝对构型糜竞芳等.药学学报，1994,29(10):758Neo-克罗烷型二萜的绝对构型谢宁等.中国药科大学学报,1995,26(3):144利用CD谱研究多糖（寡糖）的一级结构以及构象段金友等.天然产物研究与开发,2004,16(1):71七、单晶X射线衍射（X-raydiffractionmethod）X射线为短波长电磁波。当X射线照射在被测样品上时，因光的干涉作用而产生衍射效应。单晶体是指样品中所含分子（原子或离子）在三维空间中呈规则、周期排列的一种固体状态。纯度较高的化学成分在合适的溶剂系统中经重结晶可得到适合X射线衍射使用的单晶样品，其大小约为0.5mm左右。X射线照射单晶样品产生衍射效应，将所得到的衍射信息用计算机进行数据处理，再还原为分子中原子的排列关系，形成以确定规律分布在空间的衍射图像，衍射点的数目，依据化合物分子量大小（药物小分子、生物大分子、复合物等）和分子的排列规律（对称性）而异。它不仅能提供准确的分子相对或绝对构型，而且对分子的构象（及差向异构），成键原子间的键长、键角、扭角、二面角，分子平面性，分子内氢键与分子间氢键分布，晶态下分子的排列规律（即晶型），溶剂分子的分布与数目等均可提供准确、定量、可靠的信息，极大地缩短确定正确结构所需的时间。单晶X射线衍射特点：（1）只需一颗单晶体(约1/4-1/6mg)，微量成分结构鉴定；（2）对药物中共晶样品可给出准确、定量的分析结果；（3）可获得药物分子的绝对构型（全新骨架）；（4）可以准确地计算出被测化合物的构象信息：

分子骨架各环的船或椅式构象、环与环间的顺反联接方式、环自身的平面性质、环与环间的扭转角、侧链的相对取向位置、大环构象等。（5）可以准确地计算出药物分子的氢键、盐键、配位键的成键方式和数值。（6）可以确定天然药物中水溶性大分子（蛋白质、多肽、多糖类等）的准确三维结构，结晶猪胰岛素。利用单晶X射线衍射测定分子绝对构型方法：（1）含重原子的分子，利用分子中所含重原子的X射线反常散射(色散)效应，准确测定分子构型。（2）不含重原子的分子，利用非重原子C、O的反常散射效应，因为C、O、N原子的反常散射效应弱，故在X射线衍射实验中需要采用CuK

辐射，以准确地测量反常散射点对的衍射数据，如抗疟活性倍半萜青蒿素的分子绝对构型测定。（3）对于非新骨架的分子，根据文献或波谱数据，可以确定其局部取代基的构型，以此为参照，确定分子绝对构型。（4）在进行天然药物样品的重结晶过程中，选择引入手性试剂(如D或L-酒石酸等)形成共晶的单晶体，从单晶X射线衍射分析所得共晶组分的立体结构图中，以手性试剂的已知构型为参照，即可获得待测分子的绝对构型。**经1D和2DNMR数据分析确定rohitukine平面结构，哌啶环上有两个手性中心。PN53黄色粉末（氯仿-甲醇），mp>260℃（分解）。难溶于水，甲醇，吡啶，DMSO，易溶于乙酸。Dragendorff反应阳性PN53FAB-MSHR-ESIm/z：324.1226C19H18NO4（calcd.324.1236）PN53IROHArPN53UV204229282355372440稠环结构小檗碱型生物碱PN531HNMR(DMSO)PN531HNMR(DMSO+CF3COOH)7.03CH23.173.88CH37.037.033.173.887.548.738.737.547.897.859.704.897.897.85PN5313CNMR(DMSO+CF3COOH)PN5313CNMR(DMSO+CF3COOH)局部放大CH3CH2CHPN53HMQCPN53HMQCPN53HMQCPN53HMBC55.49.70136.9122.1132.6141.17.85141.1132.6149.0122.1119.77.894.04141.4Stepharanine1HNMRofhmgcdefghCH3abcdegiklfjjlAr