结核病的实验室诊断方法及评价

结核病的实验室诊断方法及评价耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC960、BacT/ALERT3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。多种以PCR为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。结核病的实验室诊断方法及评价(一)标本的采集1．痰标本采集新发病人应在抗结核药物治疗前留取痰标本。治疗中的病人应停药2～3天后留取痰标本。病人于清晨漱口后，留取3～5ml合格的痰标本(深咳后吐出的黏液痰、脓样痰、干酪样痰、褐色血样痰或含少量新鲜血液的血痰)，遇到唾液或口永，应重新留取。至少采集3次。WHO推荐的采集容器为国际通用的螺旋盖痰瓶、可密封塑料盒或蜡纸盒。痰容器上应标明病人姓名、编号、检查项目和容器序号。2.胃冲洗液幼儿不会吐痰，常将痰液咽下，故可用清晨空腹胃洗出液，直接涂片染色或进行结核杆菌培养，连续作三次可提高培养阳性率。胃液结核杆菌检出率以浸润性肺结核和干酪性肺炎为最高，其次为粟粒型肺结核。胃液、痰液或其他分泌物中结核杆菌检查，有时对诊断有决定性意义。3.支气管肺泡灌洗和支气管冲洗支气管肺泡灌洗和支气管冲洗液至少5ml并以无菌容器盛装，以用于检验。4.病灶组织或干酷块等先用组织研磨器磨碎后再行涂片。5．尿液留全量夜尿，静置4或5小时后，弃上清液，取沉淀部分尿液10ml，3000rpm．离心30min，取沉渣涂片。6.体液或脑脊液无菌操作收集体液或脑脊液，放置冰箱或室温24h，待薄膜形成后涂片。也可将脑脊液离心沉淀，3000rpm，离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片。(二)试验方法及评价1．细菌学诊断方法(1)涂片检查法：包括直接涂片法、荧光染色涂片法和集菌涂片珐。痰液、脓液可直接涂片。用萋尔-尼尔逊染色法(Ziehi-Neelsen)简称萋尼染色法，若镜检找到抗酸性杆菌，则可能是结核杆菌。此法简便、快速，技术要求低，无需特殊仪器且能当天出结果，十分经济，符合我国国情。但其敏感性差，一般需5000～10000条菌／ml才能得到阳性结果；特异性差，各种分枝杆菌均可着色，要进一步鉴定是否为结核分枝杆菌；不能区分死菌与活菌。【萋尼氏染色法】①涂片：取经95％乙醇擦拭脱脂过的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻璃片(玻片不能重复使用)，于玻片背面的左端1／3处以蓝色或黑色记号笔(玻璃铅笔)编号。用接种环挑取痰标本的脓样，干酪样部分约0.05～0.1ml，于玻片正面的右侧2／3处，均匀涂沫成10mm×20mm的卵圆形痰膜，自然干燥后待检。②试剂：⊙碱性复红乙醇染色储存液：碱性复红液：8克碱性复红溶于95％乙醇100ml中。5％石碳酸水溶液：5克石碳酸溶于100ml蒸馏水中。③染色步骤；【荧光染色法】①试剂：染色剂z金胺“O”0．1g溶于95％乙醇10ml，加5％石炭酸90ml。脱色剂：3％盐酸乙醇液。复染剂：0.5％高锰酸钾水溶液。②染色步骤：③镜检与报告方式：在暗色背景下，抗酸杆菌呈黄绿色或橙色荧光。必须用40×物镜确认菌体形态，应具有萋-纳氏抗酸染色镜经检验后，方可应用荧光染色法，注意勿过读或漏判。荧光染色后涂片应在24h内检查，遇需隔夜时，置4℃保存，次日完成镜检。物镜20×检查结果按下列标准报告：阴性(-)：0条／50视野可疑(+)；1～3条／50视野阳性(1+)：l1～99条／50视野(2+)：1～9条／每视野(3+)：10～99条／每视野(4+)：≥100条／每视野物镜40×检查细菌细胞形态。(2)常规培养法：结核分枝杆菌培养阳性是确诊结核病的“金标准”。改良罗氏培养法是目前较为成熟的分离培养方法，根据结核杆菌生长缓慢，菌落干燥、颗粒状、乳酪色像菜花状，菌体染色抗酸性强等特点判断是否为结核杆菌。如菌落、菌体染色都不典型,则可能为非典型分枝杆菌，应进一步作鉴别试验。此法培养时间长，不适于快速检测结核杆菌，且阳性率也只有30％～40％，使大量结核病人漏诊或误诊。同时各种分枝杆菌均可生长，也需进一步鉴定是否为结核分枝杆菌。⊙培养结果报告方式：抗酸杆菌培养阴性：斜面无菌落生长。抗酸杆菌培养阳性(1+)：菌落生长占斜面面积的1／4。抗酸杆菌培养阳性(2+)：菌落生长占斜面面积的1／2。抗酸杆菌培养阳性(3+)：菌落生长占斜面面积的3／4。抗酸杆菌培养阳性(4+)：菌落生长布满全斜面。抗酸杆菌培养阴性应以“(培养阴性)”报告。菌落生长不足以斜面面积1／4时，实报菌落数。(3)快速培养法：①BactecMGIT960分枝杆菌快速培养、药敏检测系统的基本原理是，其所使用的培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂，由于该显示剂为氧抑制性，当分枝杆菌生长使氧消耗后，荧光显示剂被激活而发出荧光。检测系统每隔60分钟连续测定培养管内荧光强度，来判断管内分枝杆菌生长情况。②BacTALERT3D培养系统：是另一类分枝杆菌快速培养、药敏检测系统，也可用于普通细菌的培养。其原理是所使用的培养瓶底部，有颜色感应器，当分枝杆菌在瓶中生长，有CO2产生时，颜色感应器由绿色变为黄色。系统自动连续检测数据输入计算机，根据计算结果自动显示有无分枝杆菌生长。此法无放射性，显著缩短培养时间，且操作简便、自动化强，还可进行快速菌型鉴定。但液体培养基中不能观察菌落形态，仪器与试剂价格较贵。(4)液体变色培养基(MBRedox系统)：该系统由改良米氏7H9培养基、促生长添加剂(血清、复合维生素等)、抗生素混合物PACT(多黏菌素B、两性霉素B、茶啶酸、甲氧苄胺嘧啶)和氧化还原显示器(即无色四鎓盐)组成。促生长添加剂可加速分枝杆菌的生长和甲臜(formazan)的形成。其原理是当分枝杆菌在此培养基生长时，通过氧化还原系统，使培养基中的无色四唑鎓盐还原成粉红色、红色或紫色甲臜。由于甲臜不溶于水．以颗粒形式分泌到细胞表面，分枝杆菌菌落就变成了用肉眼可见的红或紫色，取培养液涂片，染色镜检。此法操作简便，培养时间短，肉眼观察结果，无需特殊仪器，无放射性污染，还可用于分枝杆菌的药敏试验和菌种鉴定。但阳性率还不够高，结果观察存在主观性。(5)噬菌体裂解试验：由于耻垢分枝杆菌噬菌体是一种DNA病毒，能特异感染相应的活的分枝杆菌，并在菌体内迅速增殖?裂解菌体，释放出的子代噬菌体，又可感染随后加入的指示细胞(也是一种分枝杆菌)，并使指示细胞裂解，在培养平板上出现噬菌斑。根据噬菌斑的有无，即可确定待检标本中是否含有相应的活的分枝杆菌。此方法简便、快速，不需特殊仪器；特异性和灵敏度较高；检测的是活菌，但传染性小；可相对定量可测定药物敏感性。其主要步骤为：①标本前处理：同常规培养法(若用菌株则勿需此步)，经前处理后的标本于Middlebrook7H9培养基中(含有改良的OADC营养添加剂)37℃温育24h。②噬菌体浸染：取0.5ml上述处理后的样品(或菌液)，加入0．1ml分枝杆菌噬菌体，震荡混匀，37℃孵育1b。③中止浸染：于上述浸染液中加人0.1ml杀毒剂，彻底混匀，室温作用5min，加入5mlMiddlebrook7H9培养液和1ml指示细胞。④浇注平皿和培养：将上述混合培养液与5ml溶化的琼脂共同倾注于无菌平皿中，旋转混匀，静置成形后，于37℃培养18～24h。每次检测同时设空白对照、嘴菌体对照、杀毒剂对照、指示细胞对照和阴性及阳性对照。⑤结果观察：在各对照组结果正确的条件下，观察试验样品结果。阳性结果可见有大小和数量不等的噬菌斑出现(彩图2)，或许多嘴菌斑相互融合成透明状；阴性结果可见指示细胞在琼脂培养基中均匀生长．无噬菌斑出现。2．常用的免疫学诊断方法(1)酶联免疫吸附试验(enzymeLinkedimmunosorbentas-say，ELISA)：ELISA是结核抗体。研究和应用报道最多的实验方法。①ELISA间接法：其基本原理是吸附在固相载体上的结核抗原可与待检标本中的结核抗体结合，形成抗原-抗体复合物，后者与酶标记的抗人IgG结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，酶使底物显色。颜色的深浅与待检标本中的结核抗体含量成正比。本法主要用于测定结核抗体。②双抗体夹心ELISA：其原理是吸附在固相载体上的结核抗体可与待检标本中的结核抗原结合，形成抗体-抗原复合物，后者与酶标记的结核抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，酶使底物显色，颜色的深浅与待检标本中的结核抗原含量成正比。本怯主要用于特异性结核抗原的测定。③抗原竞争ELISA：其原理是吸附在固相载体上的结核抗体，可与标本中的待检结核抗原及同时加入的酶标的结核抗原发生竞争结合，形成抗体抗原和抗体-酶标抗原两种复合物，后者可使酶作用的底物显色，颜色的深浅与待检标本中结核抗原的含量成反比。本法主要用于小分子抗原的测定。(2)生物素-亲和素-酶免疫测定法(biotin-avidin-system，BAS-酶免法)：基本原理类似于ELISA，只是用BAS来标记酶，而不是用抗体或抗原标记酶。BAS有三种基本测定方法，分别称ABC法(avindin-biotin-complex)。BA法(biotin-avidin)和BAB法(bridged-avdin-biotintechnique)。前二种方法主要用于结核抗体或抗原的测定，BAB法主要用于免疫组化和免疫病理中，操作较为繁琐。(3)斑点酶免疫渗透试验(dotimmunoenzymefiltrationassav，DIEFA)：是在酶免疫结合试验基础上发展起来的一种固相标记免疫测定技术。其原理是利用微孔膜的可滤过性，使反应溶液自膜上迅速通过，从而完成抗原、抗体的快速测定。本法包被所需的抗原量少，预先包被、封闭、干燥后可长期保存备用。敏感性和特异性与ELISA法相当。但操作更简单，反应更快速，价格较便宜，结果只需肉服观察，无需特殊仪器，重复性好。(4)斑点免疫金结合试验①斑点免疫金渗透试验(dotimmunogoldfiltrationassay，DIGFA)：基本步骤为：本法用胶体金标记抗人IgG，由于胶体金本身呈红色，不需再加显色底物，阳性反应即为红色斑点。比ELlSA法减少了加入底物和终止液的步骤，操做更为简便快速；本法在可滤过性膜上进行抗原、抗体反应，反应时间仅为3～5min；金标试剂比酶标试剂稳定，室温保存时间较长。②斑点免疫层析试验(dotimmunochromatographicassavDICA)：DICA的反应物与DIGFA基本相同，反应物固定在一狭长的微孔膜上，制成单一试剂形式，反应利用膜的毛细管作用进行。微孔膜A端含有干燥的金标抗人IgG，中段点有特异性结核抗原，末段点有人IgG。仅需少量待检血清(或其他体液标本)滴在A端，并加人数滴稀释液，使膜中的金标抗人IgG溶解，若待检标本中含有结核抗体特异性IgG即与金标抗人I90结合形成复合物，并随液体向前方移动，至膜的中段时即与结核抗原结合，形成抗原抗体金标抗体复合物，出现红色条带为阳性结果。如待检样品中不含结核抗体，则在测试区不出现条带。液体继续往前移动，并在末段的试剂质控区与正常人IgG结合，形成Igo金标抗人IgG复合物，出现红色条带，证明试剂反应系统正常。DICA测定方法简便、快速，在结核抗体检测中受到广泛关注。(5)免疫印迹技术(immunoblotting或Westernblot)；是高分离SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)与高敏感性酶联反应相结合的一种检测技术。包括SDS、蛋白质转印和固相酶免疫测定三步。检测原理是蛋白质样品经过SDS分离后，通过转移电泳至固相膜上，并保持其原有的物质类型和生物学活性不变，然后利用抗原-抗体特异性反应进行检测。通过该技术可以了解抗原抗体反应的数目、被识别的抗原电泳迁移率以及抗原抗体反应的强度，从而有助于抗体联合检测和新抗原鉴定的研究。目前，此技术已转化为产品，只进行后半步酶联免疫反应，即可检出待检标本中所含的多种结核杆菌多肤抗原成分的特异性抗体。此法敏感性和特异性很高，是很有发展前景的测定技术，已广泛用于科研，在临床诊断活动性结核病人也有很高的价值。3．分子生物学诊断(1)核酸探针(nuclearacidprobe)：分枝杆菌的核酸探针有四种主要类型：cDNA或rRNA探针、全染色体DNA探针、克隆的DNA或PCR扩增片段探针及寡核甘酸探针等。此法特异性强，可以鉴定不同种群的分枝杆菌，有助于肺结核的诊断和鉴别诊断，但其敏感性低，价格昂贵，不适用于日常临床诊断工作。(2)聚合酶链反应(poLymerasechainreation，PCR)：主要根据DNA复制原理，其过程类似于体内细胞分裂时DNA半保留复制过程。其扩增的每一循环，包括模板变性、引物退火及延伸三个步骤。PCR技术关键是设计一对特异性DNA引物，该引物所引导的DNA扩增序列，应是结核杆菌独有的，且是结核杆菌的保守序列，这样才能保证检测结果的特异性。PCR的灵敏度高，可达1个结核杆菌。能早期诊断结核菌血症，在结核杆菌感染的早期，特别是在结核病灶通过血源性外传播时，外周血中存在极少量的结核杆菌时，通过PCR就可以检测到结核杆菌。检测时间短，仅需2～4h。目前存在的最大问题是假阳性率和假阴性率较高，造成假阳性的最主要原因是实验室污染。(3)DNA序列测定：不仅能够用于突变的检测，而且能够确定突变的部位与性质，因此是检测基因突变的最理想方法，也是判断突变的“金标准”和评价其他方法的参考方法。DNA序列测定有多种方法．但PCR-DNA序列测定简便、快速，是最常用的测定方法，已在结核分枝杆菌耐药基因研究中，得到广泛应用。随着DNA测序技术的自动化、规模化、商品化，以及成本的降低，为今后分枝杆菌基因序列的信息研究以及分枝杆菌菌种鉴定提供了便利条件。(4)基因芯片技术：又称DNA芯片技术，是近年发展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法，是目前分子生物学最前沿的方法。原理是将多种探针分子固定于支持物上，与标记样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，获取样品分子的数量和序列信息。测定耐药性的主要步骤为：①制备测定耐药性的基因芯片；②获待测样品DNA并进行PCR扩增和标记：③扩增产物与点样制备的芯片进行杂交、显色；④扫描检测、数据处理、结果判定。该法基于核酸杂交的技术，同时将大量探针固定于支持物上，所以一次可以对样品大量序列进行检测和分析，它有技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广等特点。但基因芯片的制备比较复杂，成本较高，仪器设备也较贵，不适用于临床标本的检测。目前，基因芯片技术已在结核分枝杆菌的基因分型与菌种鉴定、耐药性测定及基因组比较分析研究中得以应用，其中尤以耐药性测定最为引人关注。细胞因子检测主要包括酶联免疫吸附法（ELISA）和固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）两种。结核分枝杆菌感染人体后，刺激免疫细胞产生保护性细胞因子，其中最主要的是IFN-γ。通过检测IFN-γ浓度可对结核分枝杆菌潜伏感染及结核病的诊断提供参考。目前主要应用于结核性浆膜炎的诊断。细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT计算机分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。流式细胞术用于结核分枝杆菌药物敏感性试验的原理和步骤FCM用于结核分枝杆菌药物敏感性试验所采用的细胞染色法是乙酰乙酸荧光素（FDA）染色法。FDA是一种非极性非荧光物质，它能通过主动转运和被动扩散的方式穿透分枝杆菌的细胞壁和细胞膜。活的分枝杆菌胞质中非特异性酯酶能够迅速水解外来的FDA成为游离荧光素，游离荧光素在菌体内蓄积易被流式细胞仪测定；而死菌的活性酯酶减少，不能或仅能水解少量的FDA，产生很少的游离荧光素。FCM通过测量荧光信号的改变，判定活菌或死菌，从而用于结核分枝杆菌药物敏感性试验。将一定量的结核分枝杆菌菌悬液加入到一定浓度抗结核药物的液体培养基，37℃培养24h（或48h）；同样数量的结核分枝杆菌菌悬液加入到不含抗结核药物的液体培养基中，37℃培养24h（或48h）作为质控；取上述菌悬液加入到混有FDA的PH7.4的PBS中，37℃静置30min后，加入到FCM的样品管进行检测，利用FCM随机软件对每min细胞数（标记的结核分枝杆菌数）和平均荧光强度（标记的结核分枝杆菌荧光强度）两项参数进行分析，从而对结果进行统计分析。蛋白芯片在结核分枝杆菌研究中的应用现有的结核蛋白芯片是以微孔滤膜为载体，将结核分枝杆菌的特异性抗原如阿拉伯甘露糖（LAM），38Kda蛋白和16Kda蛋白等固定在其表面，利用微孔滤膜的渗透、浓缩、凝聚作用，捕捉被检样品中的特异性抗体，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，再以免疫金作为标记物而直接在膜上显色形成紫红色的斑点。显色后通过芯片识别系统进行分析，判定结果用于该类细菌感染的临床辅助诊断。其特点是可对多种结核分枝杆菌抗原之抗体进行同时筛查，方便、快速而又有较高的特异性与敏感性，对于痰涂阴性、无痰的、肺外结核病人的检出，更显示其优越性。噬菌体生物扩增法检测Bactec