荧光分光光度计法测定丽娃河

荧光分光光度计法测定丽娃河水体中叶绿素实验报告姓名：毕倩倩学号：51102601010专业：海洋化学指导老师：高磊实验目的了解荧光分光光度计仪器的原理及用途掌握本实验叶绿素测定的原理及简单实验操作荧光分光光度计仪器组成及原理荧光分光光度计仪器主要由以下5个组成部分：光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm〜400nm范围内强度几乎相等，故较常用。>激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。筛选出特定的发射光谱。样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。>检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大并转为电信号。工作原理：由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态这些处于激发态的分子是不稳定的，在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光。不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。在溶液中，当荧光物质的浓度较低时，其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系，即IF=KC，利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析。实验原理在自然水体中，叶绿素存在于浮游植物的细胞当中，其含量能够反映水体中浮游植物的数量。水样采集之后，经过过滤，将浮游植物附着在滤膜之上。再经过90%丙酮萃取，最后定容，测定萃取液中的叶绿素浓度。本次实验利用分光光度计来测定叶绿素浓度。它采用430nm的紫外光光源照射叶绿素样品，从而激发叶绿素产生荧光，所产生的荧光越强，叶绿素的浓度也越高，二者成线性正相关。通过标准曲线的制作可得出叶绿素浓度与光强的对应关系。通过这种对应关系确定叶绿素计算公式中的待定系数。最后根据叶绿素浓度公式和待测样品所得出荧光值即可计算出。另外，叶绿素的测定中需要添加酸化步骤。这是因为除了叶绿素以外还有其他物质被萃

取到丙酮中，在受到紫外光照射时它们也可能产生荧光。加酸后，可以破坏掉所有的叶绿素，再测定荧光强度，用酸化前的减去酸化后的数值所得出的即为叶绿素所占的部分。实验仪器及材料荧光分光光度计(日立F-2500)过滤装置(含手泵)移液枪5ml、1ml石英皿、擦镜纸塑料样品管parafilm膜2张0.7pmwhatmanGF/F膜镊子量筒丽娃河水500ml丙酮10%HCl溶液实验步骤(1)用镊子加入1张0.7pmwhatmanGF/F膜于过滤装置的滤芯上，拧好白色塑料圈，取250ml丽娃水倒入过滤装置，用手泵减压，使水样通过滤膜过滤，至膜表面干即可。打开白色塑料圈，将过滤好的滤膜折叠好加到塑料样品管中，且放入底部，加入5ml丙酮，盖上盖子，震荡10-15s，搅拌均匀。用parafilm膜封住盖口，写好标签。另在重复一次操作。结束后，将样品管放置在冰箱中冷冻。(2)24h后，将两个样品管取出，震荡10-15s，用Milli-Q水润洗石英皿3遍，用(2)1ml移液枪去上层清液2ml，用擦镜纸拭干石英皿表面水，放入仪器的样品池中，上机测量。仪器的设置为:Response:2.0sEMEndML:685nmResponse:2.0sEMEndML:685nmReplicate:3Scanspeed:300nm/mincycletime:0minDelay:20sEX:10nmdatamode:fluorescenceEm:215nmExWL:430nmPMTVoltage:700VEMstartML:660nm测试完，读取3个数据，然后向石英皿中滴加一滴10%HCl溶液，再测量，读取3个数据。实验结果与讨论Samplel：酸化前三次数据：163.5、160.7、162.3平均值：162.17酸化后三次数据：72.66、73.39、72.64平均值：72.90Sample2：酸化前三次数据：169.1、169.9、170.2平均值：169.73酸化后三次数据：73.82、73.82、72.30平均值：73.31chl-achl-a(ug/L)=x(F-F)xKxx0'Vol}VolXVfilt)其中Fm：酸化比，取Fm=2.2Fo：加酸前3次读数平均值Fa：加酸后3次读数平均值Kx：标准曲线斜率，取Kx=1.9086Volex:萃取体积，取Volex=5.8mlVolfilt：过滤体积，单位与Volex一致，也为ml讨论：可以看出两个平行实验Sample1和Sample2计算出来的叶绿素的值相差不是很大，平均值为7.537mg/L，计算出来的相对标准偏差为3.8%，这可能是由于实验误差或者系统误差导致的。目前水体富营养化一般采用的指标是：水体中氮含量超过0.2-0.3ppm，生化需氧量大于10ppm，磷含量大于0.01-0.02ppm，pH值7-9的淡水中细菌总数每