乳及乳制品微生物检测-克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）的测定

克罗诺杆菌属定性检验一二三四五六方法来源设备和材料培养基和试剂检验程序操作步骤

结果与报告一、方法来源此方法来源于国家标准GB4789.40-2016，该标准规定了食品中克罗诺杆菌属(Cronobacter)的检验方法，适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中克罗诺杆菌属的检验。二、设备和材料1.恒温培养箱：25℃±1℃，36℃±1℃，44℃±0.5℃。2.冰箱：2℃~5℃。3.恒温水浴箱：44℃±0.5℃。4.天平：感量0.1g。5.均质器。拍打式均质器二、设备和材料6.振荡器。7.无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。8.无菌锥形瓶：容量100mL、200mL、2000mL。9.无菌培养皿：直径90mm。10.pH计或pH比色管或精密pH试纸。11.全自动微生物生化鉴定系统。振荡器三、培养基和试剂1.缓冲蛋白胨水(bufferpeptonewater，BPW)2.改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium，mLST-Vm)3.克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）显色培养基。4.胰蛋白胨大豆琼脂(trypticasesoyagar，TSA)5.克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）生化鉴定试剂盒。北京陆桥ESM008A阪崎肠杆菌显色培养基

三、培养基和试剂6.氧化酶试剂7.L-赖氨酸脱羧酶培养基8.L-鸟氨酸脱羧酶培养基9.L-精氨酸双水解酶培养基10.糖类发酵培养基11.西蒙氏柠檬酸盐培养基北京陆桥阪崎肠杆菌干制生化鉴定试剂盒四、检验程序图25.6克罗诺杆菌属检验程序五、操作步骤（一）前增菌（二）选择性增菌（三）平板分离（四）平板确认（五）生化鉴定注意：克罗诺杆菌属为致病菌，以下操作请在生物安全柜中进行。五、操作步骤取检样100g(mL)置灭菌锥形瓶中，加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，用手缓缓地摇动至充分溶解，36℃±1℃培养18h±2h。使用的增菌液为缓冲蛋白胨水（BPW），它营养丰富，有利于培养环境形成缓冲体系。（一）前增菌图25.7100g样品加900mL增菌液未混匀状态（左）和混匀状态（右）五、操作步骤移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。选择性增菌液使用的是改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨加万古霉素增菌液(mLST-Vm)。改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨含盐量高，有利于筛选耐高渗透压的克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌），因前增菌已经优化，仅使用1mL前增菌液即可。万古霉素能有效抑制革兰氏阳性菌（G+）生长，较高温度培养可以抑制其他细菌生长，而克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）能在高温下生长更好。注意改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨（mLST-Vm）灭菌后使用前再加万古霉素，放置时间不超过24h。要求44℃培养，温度波动＜0.5℃。（二）选择性增菌五、操作步骤轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌培养物1环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板，显色培养基须符合GB4789.28的要求，36℃±1℃培养24h±2h，或按培养基要求条件培养。一种显色培养基为添加5-溴-4-氯-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷(XαGLC)的胰蛋白胨琼脂（TSA），克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）产生的特异性α-葡萄糖苷酶可以分解底物形成蓝绿色菌落，选择性极佳。在添加4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷(Na+α-MUG)的培养基上可产生荧光菌落，也可作为克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）选择性培养基使用。（三）平板分离图25.8选择性培养基上的疑似克罗诺菌属菌落五、操作步骤挑取至少5个可疑菌落，不足5个时挑取全部可疑菌落，划线接种于TSA平板。25℃±1℃培养48h±4h。在TSA培养基上产生黄色色素的为高度疑似菌落。（四）平板确认图25.9胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）上的平板确认五、操作步骤自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。克罗诺杆菌属的主要生化特征见表25.2。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，操作方法见项目25技能点2。（五）生化鉴定生化实验特征黄色素产生+氧化酶-L-赖氨酸脱羧酶-L-鸟氨酸脱羧酶(+)L-精氨酸双水解酶+柠檬酸水解(+)发酵D-山梨醇(-)L-鼠李糖+D-蔗糖+D-蜜二糖+苦杏仁甙+注：+＞99%阳性；-＜99%阴性；(+)90%～99%阳性；(-)90%～99%阴性。表25.2克罗诺杆菌属的主要生化特征六、结果与报告综合菌落形态和生化特征，报告每100g(mL)样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。克罗诺杆菌属的计数一二三四方法来源

设备和材料培养基和试剂操作步骤一、方法来源此方法来源于国家标准GB4789.40-2016，该标准规定了食品中克罗诺杆菌属(Cronobacter)的检验方法，适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中克罗诺杆菌属的检验。二、设备和材料1.恒温培养箱：25℃±1℃，36℃±1℃，44℃±0.5℃。2.冰箱：2℃～5℃。3.恒温水浴箱：44℃±0.5℃。4.天平：感量0.1g。5.均质器。6.振荡器。无菌均质器二、设备和材料7.无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。8.无菌锥形瓶：容量100mL、200mL、2000mL。9.无菌培养皿：直径90mm。10.pH计或pH比色管或精密pH试纸。11.全自动微生物生化鉴定系统。全自动微生物生化检定系统三、培养基和试剂1.缓冲蛋白胨水(bufferpeptonewater，BPW)2.改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium，mLST-Vm)3.克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）显色培养基。4.胰蛋白胨大豆琼脂(trypticasesoyagar，TSA)5.克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）生化鉴定试剂盒。6.氧化酶试剂三、培养基和试剂7.L-赖氨酸脱羧酶培养基8.L-鸟氨酸脱羧酶培养基9.L-精氨酸双水解酶培养基10.糖类发酵培养基11.西蒙氏柠檬酸盐培养基四、操作步骤（一）样品的稀释（二）分离、鉴定（三）结果与报告注意：克罗诺杆菌属为致病菌，以下操作请在生物安全柜中进行。四、操作步骤1.固体和半固体样品无菌称取样品100g、10g、1g各三份，分别加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的BPW，轻轻振摇使充分溶解，制成1∶10样品匀液，置36℃±1℃培养18h±2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。（一）样品的稀释四、操作步骤2.液体样品以无菌吸管分别取样品100mL、10mL、1mL各三份，分别加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的BPW，轻轻振摇使充分混匀，制成1∶10样品匀液，置36℃±1℃培养18h±2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。（一）样品的稀释四、操作步骤具体内容见项目25技能点1和项目25技能点2。（二）分离、鉴定分离培养基上的克罗诺杆菌属四、操作步骤综合菌落形态、生化特征，根据证实为克罗诺杆菌属的阳性管数，查MPN检索表，报告每100g(mL)样品中克罗诺杆菌属的MPN值(见表25.3)。（三）结果与报告阳性管数MPN95%可信限阳性管数MPN95%可信限100101下限上限100101下限上限000＜0.3-0.952202.10.454.20010.30.0150.962212.80.879.40100.30.0151.12223.50.879.40110.610.121.82302.90.879.40200.620.121.82313.60.879.40300.940.363.83002.30.469.41000.360.0171.83013.80.87111010.720.131.83026.41.7181021.10.363.83104.30.918表25.3克罗诺杆菌属的MPN值1100.740.1323117.51.7201111.10.363.8312123.7421201.10.364.2313164421211.50.454.23209.31.8421301.60.454.2321153.7422000.920.143.8322214432011.40.364.232329910020220.454.2330244.21002101.50.374.233146920021120.454.2332110184102122.70.879.4333＞11042-注1：本表采用3个检样量[100g(mL)、10g(mL)和1g(mL)]，每个检样量接种3管。注2：表内所列检样量如改用1000g(mL)、100g(mL)和10g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用10g(mL)、1g(mL)和0.1g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。克罗诺杆菌属

检测意义、原理及方法一二三克罗诺杆菌属的检测意义克罗诺杆菌属的检测原理克罗诺杆菌属的检测方法一、检测意义（一）克罗诺杆菌属概述（二）克罗诺杆菌属分布（三）克罗诺杆菌属致病性和致病物质（四）克罗诺杆菌属的治疗和控制预防一、克罗诺杆菌属的检测意义1961年英国Franklin等首次报道了2例产黄色素阴沟肠杆菌致新生儿脑膜炎以后，相继在世界范围内(美国、冰岛、荷兰等国家)报道了一系列新生儿产黄色素阴沟肠杆菌感染事件。1980年Farmer等在文献中指出通过DNA杂交他们发现产黄色素阴沟肠杆菌之间DNA一致性可达83%～89%，而产黄色素阴沟肠杆菌与阴沟肠杆菌的DNA共有序列只有31%～49%，建议对产黄色素阴沟肠杆菌重新分类。最终产黄色素阴沟肠杆菌被认为是一个新的菌种，并以日本微生物学家——RiichiSakazakii的名字命名，即阪崎肠杆菌（Enterobactersakazakii）。（一）概述一、克罗诺杆菌属的检测意义2004年2月WHO/FAO就婴儿配方奶粉含阪崎肠杆菌课题召开专家会议，做了初步的危险评估，将阪崎肠杆菌列为婴儿配方奶粉中的A类致病菌。2004年3月，国际食品法典委员会（CAC）的食品卫生委员会（CCFH）同意尽快修订婴幼儿食品卫生操作国际标准，包括阪崎肠杆菌及相关微生物的微生物学标准。（一）概述一、克罗诺杆菌属的检测意义最近几年的研究结果建议对阪崎肠杆菌进行新的分类，在阪崎肠杆菌的分类关系发生变化之后，由一个种成为一个新属，即克罗诺杆菌属(Cronobacterspp.)，该属包括6个种和3个亚种，这6个种分别是阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)、苏黎世克罗诺杆菌(Cronobacterturicensis)、都柏林克罗诺杆菌(Cronobacterdublinensis)、穆汀斯克罗诺杆菌(Cronobactermuytjensii)、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(Cronobactermalonaticus)、克罗诺杆菌基因种1(Cronobactergenomospecies1)。（一）概述一、克罗诺杆菌属的检测意义婴儿配方粉在制造过程中要经过巴斯德消毒，克罗诺杆菌经过这样的处理后不可能继续存活。因此，终产品中克罗诺杆菌的污染很可能是来自厂房环境、巴斯德消毒后添加热敏感性微量元素的过程或配方粉的冲调期。1.环境2003年Hamilton等从厩螫蝇（Stomoxyscalcitrans，图25.1）肠中分离到克罗诺杆菌，据此认为厩螫蝇幼虫肠道是克罗诺杆菌的环境宿主之一。（二）分布图25.1厩螫蝇（Stomoxyscalcitrans）——克罗诺杆菌的环境宿主之一一、克罗诺杆菌属的检测意义2.食品及相关用品在设计预防新生儿克罗诺杆菌感染措施时，应该考虑到克罗诺杆菌环境分布的广泛性。值得一提的是与婴幼儿密切相关的食物和用具，例如婴儿配方奶粉、普通奶粉、豆粉、碎牛肉、肉类、香肠、发酵面包、豆腐、蔬菜、水（水管道、水过滤膜）、调味品、干酪、婴儿配方粉冲调用具（搅拌器、勺子、甁刷）等的卫生状况尤为值得关注。（二）分布图25.2阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）DNA“指纹图谱”比对，发现问题食品示意图一、克罗诺杆菌属的检测意义3.婴幼儿配方乳粉的污染Breeu.Wer等研究发现克罗诺杆菌并非具有特殊的耐热性，但能耐受一定程度的渗透压和干燥。研究结果证明，克罗诺杆菌的耐热性不足以使该菌经标准的巴斯德消毒后幸存，产品的污染很可能发生在干燥和罐装阶段。与大肠埃希菌、沙门氏菌相比，克罗诺杆菌对渗透压和干燥具有更高的耐受力，这很可能与细胞内大量的海藻糖酶导致细胞内累计大量海藻糖有关。（二）分布图25.3克罗诺杆菌属的污染途径一、克罗诺杆菌属的检测意义1.致病性克罗诺杆菌属感染的大多数病例都是婴儿，特别是早产儿、出生体重偏低等身体状况较差的新生儿。感染主要引起脑膜炎、菌血症、坏死性小肠结肠炎，该菌偶尔还可引起成人局部感染和菌血症等。（三）致病性和致病物质一、克罗诺杆菌属的检测意义1）婴幼儿脑膜炎未足月出生的新生儿占75%。主要表现为发热，面色苍白，有抽搐或颤抖，张力亢进，囟门隆出，无颈项强直。合并有菌血症者占5/8，坏死性小肠结肠炎占2/8，死亡率高达75%。克罗诺杆菌引起的脑膜炎常引起脑梗塞、脑脓肿、囊肿形成和脑室炎等并发症，并且可引起神经系统后遗症或迅速死亡。（三）致病性和致病物质一、克罗诺杆菌属的检测意义2）新生儿菌血症寒战，白细胞偏低，血液培养分离可得到克罗诺杆菌，多数症状较轻，如出现严重的脓毒血症，死亡率可达36%3）新生儿坏死性小肠结肠炎多发生于未足月出生体重较轻的婴幼儿。4）成人感染克罗诺杆菌引起成人菌血症或局部感染。（三）致病性和致病物质一、克罗诺杆菌属的检测意义2.致病物质Pagotto等在2003年首次描述了某些阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）可能产生一种毒力因子——类肠毒素样化合物。组织培养发现一些菌株可产生细胞毒效应。Townsend等发现婴儿配方奶粉中含有细菌脂多糖——内毒素（LPS），具有热稳定性，能增加小肠上皮细胞通透性，促使细菌侵入肠壁中而致病。Mange等通过体外组织细胞培养实验观察到克罗诺杆菌对人类上皮细胞和脑微血管内皮细胞有吸附粘连特性，并形成丛生，表面形成生物保护膜。（三）致病性和致病物质一、克罗诺杆菌属的检测意义1.治疗克罗诺杆菌属对先锋霉素Ⅰ和新诺明之外的所有试验用药敏感，且对氨比西林敏感。虽然克罗诺杆菌属的最佳抗生素治疗方法尚未确定，但在大数早期报告的病例中都是应用氨比西林和庆大霉素联合疗法。（四）治疗和控制预防一、克罗诺杆菌属的检测意义2.控制预防1）制定相应管理办法2）加强技术研究3）对特定消费群体加大宣传力度对婴幼儿奶粉消费者群体进行克罗诺杆菌属致病性和预防措施的宣传，尤其强调用商业无菌液体或开水冲调配方食品，喂养婴幼儿后剩余的调配食品应放置冰箱保存，并在食用前再加热。（四）克罗诺杆菌属的治疗和控制预防二、检测原理（一）克罗诺杆菌属形态（二）克罗诺杆菌属的生理、生化反应（三）克罗诺杆菌属的生态特性（四）克罗诺杆菌属的增殖能力二、克罗诺杆菌属的检测原理1.个体形态和染色反应克罗诺杆菌属为革兰氏阴性（G-，图25.4）无芽孢杆菌、周身菌毛，有鞭毛，有动力，大多数产黄色素。2.群体（菌落）形态在添加5-溴-4-氯-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷(XαGLC)的胰蛋白胨琼脂（TSA）上，因克罗诺菌属有α-葡萄糖苷酶活性，分解底物形成蓝绿色菌落，选择性极佳（图25.5），它现已作为克罗诺杆菌属的选择性培养基。（一）形态图25.4显微镜下克罗诺杆菌属革兰氏染色图图25.5添加XαGLC的TSA培养基上克罗诺杆菌属菌落二、克罗诺杆菌属的检测原理1.营养需求克罗诺杆菌属营养要求不高，能在胰蛋白胨琼脂(TSA)、脑心浸液琼脂(BHI)、血平板、麦康凯(Mac

Conkey，MAC)琼脂、伊红美蓝琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。2.酶和代谢产物克罗诺杆菌属产酶种类和反应特性，代谢产物的种类、产量、显色反应等生化特征见表25.1。（二）生理、生化反应生化实验特征黄色素产生+氧化酶-L-赖氨