不同原料中的六氢过氧化物裂解酶提取工艺研究

不同原料中的六氢过氧化物裂解酶提取工艺研究

植物氢氧化分解酶（hpl）是植物脂氧化过程中由脂氧合酶（lox）下游的酶。这些酶可由脂肪氧化酶和多甲基脂肪酸组成的氢过氧化脂肪酸分解而成。它是植物产生清香风味成分基本途径(LOX/HPL)的关键组成部分之一,且其催化产物还与植物抗病、抗虫害有关。近年来由于人们对天然香料的青睐,氢过氧化物裂解酶也逐渐受到人们的关注。本课题对不同植物中氢过氧化物裂解酶含量进行比较和筛选,并选择苋菜氢过氧化物裂解酶为研究对象进行初步分离纯化和性质研究。本研究为酶法生产C6挥发性醛类奠定坚实的基础。这是首次从中国种植苋菜中分离纯化得到氢过氧化物裂解酶。1材料和方法1.1-blox、脂肪酸、亚麻酸、己烯醛、己烯醛等青椒、苋菜、茄子、豌豆苗、菠菜和绿豆芽均购于当地农贸市场。二硫苏糖醇(DTT)、大豆脂肪氧合酶typeⅠ-B(LOX)、亚油酸、亚麻酸、己醛、己烯醛均购于Sigma公司。其他试剂为分析纯。CXG-I型电脑恒温层析柜、HL-2型恒流泵、BS2-100型自动部分收集器,上海沪西设备厂;羟基磷石灰柱填料,上海Bio-red公司;DEAE-Tog-opeval柱顶料,上海TOSOH公司;柱套、上海锦华层析设备厂。1.2实验方法1.2.1lox-硼酸盐缓冲液的制备100mg亚麻酸或亚油酸溶于2mL无水乙醇中,后转移至预先通氧气至饱和的100mL0.2mol/LpH9.0的硼酸盐缓冲液中,随后加入3mg溶入少量的硼酸盐缓冲液的LOX。快速搅拌均匀后在冰浴和持续通氧条件下反应1.5h,随后用6mol/LHCl调节反应液至pH3.0以下结束反应。用等体积无水乙醚萃取反应液2次后合并有机相,加入无水MgSO4干燥,过滤后在30℃下旋转蒸发除去乙醚,残留部分为亚麻酸氢过氧化物(13-HPOT)或亚油酸氢过氧化物(13-HPOD)溶于一定量乙醇,充氮后分装于-20℃下密封保存。1.2.2氢过氧化物裂解酶盐析100g不同原料(青椒去籽去蒂、茄子去心去籽、绿豆芽子叶、豌豆苗叶、菠菜叶、苋菜叶)与300mL0.1mol/LpH6.8的Tris-HCl(含0.5%PVP),匀浆3次共1min得粗均浆液。4层纱布过滤,滤液于30000g、4℃离心20min,弃去上清液,沉淀为氢过氧化物裂解酶(HPL)膜组分。而后用50mL含0.5%Triton-X100的0.1mol/LpH8.5的Tris-HCl(和5mmol/LDTT)溶解沉淀,4℃下搅拌1h,在30000g、4℃下离心20min,上清液即为溶解膜组分待用。1.2.3线性下降检验采用分光光度法测定氢过氧化物裂解酶(HPL)的酶活。取xμL酶液(15～40μL,因原料不同而不同)和15μL10mmol/L底物(13-HPOD或13-HPOT)与合适pH下的(2985-x)μL0.02酸盐缓冲液混合,在234nm、1min内测定其吸光值的线性下降。空白用xμL酶液和(3000-x)μL磷酸盐缓冲液混合。1U酶活定义为每分钟每裂解1μmol/L13-HPOD/13-HPOT所需的酶量(ε=25000mol/(L·cm).1.2.4测定蛋白质含量的测定采用的BCA法测定。1.2.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制所用的缓冲液为pH5.0的0.02mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,pH6.0、pH7.0、pH8.0的0.02mol/L磷酸盐缓冲液,pH9.0的0.02mol/L硼酸盐缓冲液。1.2.6tritronx-100微生物滤膜的制备苋菜经1.2.2所述处理后经硫酸铵分级沉淀(5%～35%饱和度)再于40000g、4℃下离心30min得沉淀,用少量0.01mol/L,pH6.8的磷酸钠缓冲液(其中含1mmol/LDTT和0.5%TritronX-100(缓冲液A))溶解后在相同缓冲液中透析过夜,在40000g、4℃下离心30min,取上清液过0.22μm微孔滤膜。过膜后酶液上经缓冲液A平衡过的羟基磷灰石柱(2.6cm×15cm),用含0.01、0.25和0.4mol/L磷酸钠的缓冲液A进行阶段洗脱,流速为3.0mL/min,收集有酶活部分,用35%硫酸铵沉淀,离心,倒掉上清液,用少量0.02mol/L,pH8.5的Tris-HCl缓冲液(其中含1mmol/LDTT和0.5%TritronX-100(缓冲液B))溶解,再在缓冲液B中透析过夜。将透析液离心后,去上清,上经缓冲液B平衡的DEAE-Toyopearl柱((1.1cm×8.0cm),用含0,0.15,0.25和1.0mol/LNaCl的缓冲液B进行阶段洗脱,流速为1.0mL/min,收集有酶活部分,用100ku的超滤管浓缩(15mL,Millipore,上海,中国)待用。1.2.7聚丙烯酰胺终浓度对蛋白的影响依照Laemmli进行纯化HPL样品的十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS)。分离胶和浓缩胶的聚丙烯酰胺终浓度分别为12%(w/v)和4%(w/v)。蛋白用考马斯亮蓝染色。标准分子量蛋白为:兔磷酸化酶b(97400u),牛血清白蛋白(66200u),兔肌动蛋白(43000u),牛碳酸酐(31000u),胰蛋白酶抑制剂(20100u)和鸡蛋清溶菌(14400u)。1.2.8hpl残留活性的测定将粗酶液与0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液的反应体系,分别在25、30、35、40、45、50℃以及55℃水浴中保温一定时间后立即冰浴冷却至室温后,测定HPL的残留活性。2结果与讨论2.1ph的适应性为了更准确地比较不同原料中HPL的酶活,先对其最适pH值进行了测定。由表1可以看出,几种原料的最适pH值在5.5～7.0,且对于13-HPOD和13-HPOT其最适pH基本相同;而据报道,梨、茶叶和大豆子叶中最适pH都在中性。不同来源的HPL对pH的敏感程度不同。青椒、苋菜HPL的最适pH在6.0附近,对pH的上升较敏感;而豌豆苗和菠菜最适pH在7.0左右,且对pH下降比较敏感。茄子HPL在pH值6.0～8.0酶活能够维持在90%以上,在pH5.0时大约为80%,在pH9.0时仍能维持在60%以上,说明茄子HPL有着一个较宽的工作pH。2.2hpl的底物选择性根据表1,在不同来源HPL的最适pH下分别测定其活力,结果见图1。苋菜HPL的活性显著高于其他被选原料。因此选用苋菜叶作为原料提取HPL。由图1可知,所选原料中HPL对13-HPOT的活力更高。与Fauconnier等人和Shibata等人发现番茄和青椒中的HPL也有类似的底物特异性的报道相吻合。然而,Olias等人报道,在大豆幼苗中,HPL对13-HPOD的特异性高于13-HPOT。据报道,酶的特异性与生物体内真实脂肪酸组成是一致的。在苋菜叶中,亚麻酸是主要脂肪酸(占42%),这符合HPL的底物特异性。相类似的亚麻酸在青椒中尤为丰富,而亚油酸是在大豆幼苗中占有优势。2.3羟基磷灰石柱的纯化苋菜叶经均浆,高速离心,表面活性剂溶解和硫酸铵沉淀得到部分纯化HPL,具体结果见表2。通过高速离心得到膜组分回收了苋菜叶粗均浆液中绝大部分的HPL,而0.5%TritonX-100能将HPL从膜组分上溶解和分离,比酶活提高1.8倍。随后通过硫酸铵沉淀对HPL进行进一步纯化。经硫酸铵沉淀后的HPL粗酶液上羟基磷灰石柱,收集磷酸盐浓度为0.25mol/L的洗脱峰(见图2)用硫酸铵进行浓缩,进行下一步分离纯化。将经羟基磷灰石柱层析的酶液上DEAEToyopearl柱,结果见图3。收集活性组分,得到纯化倍数为83.3倍的HPL,酶比活为22.5U/mg,回收率为27%。2.4杏仁氢氧化酶的sdp由图4可知,经过一系列过程的纯化,得到电泳纯的HPL,在SDSPAGE图谱上基本为单一条带条带,分子质量约为55ku,与报道一致。2.5紫菜hpl活性测定由图5可以看出,苋菜HPL的合适反应温度为20～35℃,反应最适温度为25℃。由图6可知,在10～45℃加热10min,苋菜HPL活性能维持在80%以上,而高于45℃,随温度的上升,酶活迅速下降,在55℃保温10min后酶活基本完全丧失。可见HP