植酸酶在饲料中的应用

植酸酶在饲料中的应用

磷酸是动物生长、繁殖和代谢所必需的矿物质之一。谷物、豆类和油料等作物中的磷有40%~70%是以植酸的形式存在的,而以植酸磷形式存在的磷因单胃动物体内缺乏能分解植酸磷的酶而难以被利用,如在典型猪日粮中的磷的利用率只有15%,其余85%左右的磷从粪便中排出,从而造成许多问题:第一,磷资源的浪费,饲料中的磷不能得到有效利用,反而需要加入大量无机磷以满足动物对磷的需求,提高了生产成本;第二,高磷粪便对环境造成污染,饲料中85%的植酸磷被动物直接排出体外,使周围的土壤和水受到严重污染。另外,植酸磷还是一种抗营养因子,它在动物胃肠道的消化过程中会与多种金属离子(如Zn2+、Ca2+、Cu2+和Fe3+等)以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物,降低动物对这些营养物质的有效利用。植酸酶的研究从20世纪60年代就已开始,但由于对其认识不足,相对于其他工业用酶发展缓慢,到80年代时,饲料中还几乎不添加任何植酸酶。随着人们对动物营养学、饲料学研究的深入和集约化养殖的形成,植酸酶的良好前景得以体现,同时分子生物学和基因工程技术的发展,使植酸酶的规模化廉价生产成为可能,因此在饲料中应用植酸酶发展极为迅速。大量研究表明,在猪、禽日粮中添加植酸酶,每头猪可增加经济效益40~50元,并可使饲料中磷的利用率提高40%~60%,粪便中磷的排出量减少30%~50%。因此在饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。目前饲料用酶已成为世界工业酶产业中增长速度最快、势头最强劲的一部分,2006年中国酶制剂产值达4.64亿元,其中植酸酶占1.43亿元。2007年国内植酸酶销售12000t,销售额达1.44亿元(单位价格降低,为12元/kg),用于配合饲料9300多万t。到2010年,饲料用酶的市场值将达到10亿美元。饲料用酶市场迅速扩大的趋势和广阔前景,吸引了许多研究机构和公司涉足其研究。目前,饲用植酸酶等酶制剂在饲料中得到广泛的推广和应用,其效果已在全世界范围内得到确证。本文拟对近年来植酸酶的分离、生产及应用等方面进行综述,并分析进一步的研究和发展趋势。1植酸酶的分类所谓植酸酶是一类特殊的磷酸单酯酶,能够将植酸和植酸盐中的磷酸基团逐一水解,最终释放出肌醇和无机磷。植酸酶是一个广义概念,所有能够水解植酸产生无机磷的酶都可以称为植酸酶。由于对植酸酶的分类标准还不统一,目前国内外对植酸酶的分类比较混乱。例如,基于植酸酶的来源可将植酸酶分为细菌植酸酶、真菌植酸酶和植物植酸酶;基于植酸酶的最适pH可分为酸性植酸酶和碱性植酸酶;基于植酸酶水解底物植酸的立体专一性可分为3-植酸酶(myo-inositolhexakisphosphate3-phosphorylase,EC3.1.3.8)、6-植酸酶(myo-inositolhexakisphosphate6-phosphorylase,EC3.1.3.26)和5-植酸酶(myo-inositolhexakisphosphate5-phosphorylase,EC3.1.3.72),这种分类方法是从底物出发,由国际纯粹应用化学联合会-国际生物化学与分子生物学联合会(IUPAC-IUBMB)确定的。但是利用该方法来确定植酸酶的分类比较复杂,因为对每一个植酸酶的分类都需要通过色谱法对产物进行分析。另一种是从植酸酶本身的序列和结构出发,基于三维结构和催化机制,将植酸酶分为组氨酸酸性磷酸酶(histidineacidphosphatase,HAP)、beta折叠桶磷酸酶(β-propellarphytase,BPP)、半胱氨酸磷酸酶(cysteinephosphatase,CP)和紫色酸性磷酸酶(purpleacidphosphatase,PAP)等。这种分类方法比较简单,被绝大多数植酸酶研究者所采纳。2植物酸酶的应用植酸酶主要应用于饲料、食品、水产养殖及土质改良等,并正在向医药、造纸等领域进行扩展。2.1改善饲养环境,提高饲料的利用率植物性日粮是畜禽等动物的主要饲料,饲料中的磷有2/3以上是以植酸的形式存在的。但是单胃动物,例如鸡、猪,其胃肠中几乎没有植酸酶活性,所以饲料中的植酸磷不能被其较好地吸收利用,未降解的植酸则被动物以粪便的形式排出体外,残留于土壤,并进而转移到水体中被其中的微生物降解利用,造成富营养效应,影响自然界的生态平衡。同时,动物生长代谢所需要的磷还需要额外补充来满足动物生长发育的需要,又增加了饲料的成本。国内外大量的实验都证明,在饲料中添加植酸酶,可有效分解存在于饲料中的植酸,释放无机磷,提高饲料中植酸磷的利用率,降低粪便中磷的排放量,减少环境污染。同时因为解除了植酸的抗营养作用,所以植酸酶的添加可以提高单胃动物对淀粉、脂肪和蛋白质等营养物质的利用率,还能释放被植酸鳌合的各种矿物元素,从而促进动物健康快速的生长。表1列出了几种商品化植酸酶及其用于添加的饲料类型。2.1.1减少了肉毒和发挥营养成分一般认为,在饲料中添加植酸酶可以使磷的利用率提高20%~50%。Simons等报道在玉米-豆粕日粮中添加微生物植酸酶,磷的利用率提高了60%;Cromwell等报道在猪的玉米-豆粕型日粮中添加植酸酶,粪便中磷排泄量减少了34%~54%。Waldroup等报道在以豆饼为基础日粮的肉鸡饲料中添加植酸酶,大约有50%植酸磷被释放。在国内,白东清等研究了植酸酶对钙、磷利用效率的影响,发现在鱼饲料中添加植酸酶可以使鲤鱼对饲料中总磷的利用率提高105%~122%,其中植酸磷的利用率为74%~89%。2.1.2在低磷饲料中添加植酸酶在饲料中添加植酸酶,不仅可促进植酸磷的生物利用率,而且还释放了被植酸螯合的其他各种矿物元素,例如Ca2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+和Mn2+等,增加了它们的利用率,促进了动物矿质营养的平衡,进而改善动物的组织结构。Sebastian等发现在低磷饲料中添加植酸酶,可使公鸡体内磷、钙、铜和锌等元素的相对沉积率分别提高12.5%、12.2%、19.3%和12.3%,增加仔鸡体重,促进骨骼矿化。由于植酸往往与蛋白质、脂肪等大分子形成复合物,而植酸酶水解植酸后可以解除其与蛋白质的复合,使蛋白质被释放出来,因此可以提高动物对蛋白质的消化作用。例如白东清等发现饲料中添加植酸酶可以使鲤鱼对蛋白质和脂肪的利用率约提高11%和12%。综上所述,在饲料中添加植酸酶可以使动物的生长性能得到提高。大量实验已表明,饲料中添加植酸酶对禽类有明显的增重效应,并改善饲料利用率,降低饲料成本。对于猪的喂养,用植酸酶替代无机磷,也可以明显增加猪的体重,并减少饲料中未被利用的磷排放到环境中造成环境污染。2.2植酸酶系统分离对豆奶分离的影响植酸广泛地存在于植物来源的食品中,在许多主要的食品原料如豆类、谷物和油料作物中植酸含量很高。人也是单胃动物,同样面临着无法降解植酸的问题。1996年,美国已经允许植酸酶作为食品添加剂使用。植酸酶可以提高植物性原料食品中磷及其他矿质元素的利用率,提高对蛋白质、淀粉和脂肪等营养物质的利用率。Anno等和Khare等都成功地用小麦植酸酶来消除豆奶中的植酸,使奶产品更加易于吸收,Simell等用植酸酶来制备无植酸大豆蛋白,大大提高了蛋白质的溶解率。在我国,食用豆类蛋白比较多,将植酸酶应用到豆制品加工中,具有更加重要的意义。2.3肌醇磷酸在血小板信号转导中的作用肌醇和它的衍生物可以作为代谢机制研究底物、稳定剂和酶抑制剂,在药物和立体异构体的生产中具有广泛的应用前景。肌醇磷酸在抑制肾结石、结肠癌和糖尿病等病症中有重要作用,另外还有抗血小板凝聚和消炎等作用。此外,肌醇磷酸还可用于信号转导的研究。Greiner等利用固定化植酸酶制备了1,2,3,4,5-五磷酸肌醇、2,3,4,5-四磷酸肌醇、2,4,5-三磷酸肌醇和2,5-二磷酸肌醇。植酸的酶解产物主要有D-1,2,6-三磷酸肌醇、D-1,2,5-三磷酸肌醇、L-1,3,4-三磷酸肌醇和1,2,3-三磷酸肌醇。用植酸酶以植酸作为底物来生产肌醇和各种肌醇磷酸盐具有水解产物立体异构专一、反应条件温和、生产成本低等优点,具有广泛的工业应用价值。2.4降低饲料成本在水产养殖中,鱼饲料的成本占鱼类生产总费用的70%,因此降低鱼类生产成本的关键所在是如何降低饲料成本。在大多数鱼的消化道中植酸酶比家禽和猪肠胃中的更少,所以不能有效利用饮料中的植酸磷,这些未被利用的植酸磷被直接排放到水体中,对水体环境具有很大的破坏力,所以植酸酶在水产养殖业的应用不仅可以降低生产成本,同时可使水环境中的磷保持稳态平衡。2.5玉米种植中植酸酶的应用在很多地方植酸及其衍生物中的磷含量占土壤中总磷量的50%以上。Findenegg等在种植玉米的土壤中添加植酸酶来降解土壤中的植酸,释放无机磷,使玉米可以更加有效地利用土壤中的磷而得到快速的生长,提高了玉米的产量。该研究也表明在转基因植物的根部表达植酸酶从而利用土壤中植酸磷来促进生长是可行性的,同时还具有改善土壤中磷分布的可能性。2.6加密合成剂量,减少污染除了以上的几个方面,植酸酶还应用在许多新兴的工业上,例如,在造纸业中植酸酶可作为添加剂,提高纸张的质量,减少污染;植酸酶还可以和木聚糖酶一起形成多酶体系应用在纸浆的制造业;植酸酶可用于提高大豆中免疫性较强的2种抗原蛋白β-伴豆球蛋白(β-conglycinin)和大豆球蛋白(glycinin)的分离效率。3理想植酸酶的研究进展尽管植酸酶的种类很多,性质各异,应用前景也较大,但是却没有一个真正理想的可用于生产的植酸酶。Lei等提出了饲料工业中“理想植酸酶”的概念。理论上所谓“理想植酸酶”必须具备以下几个条件:催化效率高、抗蛋白酶水解、很好的热稳定性且价格低廉等。事实上,这种理想的植酸酶到目前还没有报道。获得优质植酸酶仍然是目前研究开发工作的重点,可以通过以下几种途径继续获得。3.1新型饲用酶的筛选和筛选自然界中微生物所产生的酶具有丰富性和多样性,为了满足饲用植酸酶生产及应用的特殊要求,需要采用各种方法进行资源挖掘,尤其是特殊环境和极端环境的微生物资源。传统的酶或基因分离方法是基于微生物的分离培养,筛选分离单个基因或蛋白质,并序列分析。随着生物技术、基因和蛋白质序列数据库以及生物信息学的发展,新型饲用酶及其编码基因的分离获得效率得到了很大提升。近年来,高通量筛选已经成为基因或酶蛋白分离的主要手段。目前已报道了来源于细菌、真菌、植物及动物的各种不同植酸酶,均表现出多样性的酶学性质。中国农业科学院饲料研究所构建了饲料用酶高效筛选平台,从各种特殊或极端环境中分离了200多个饲料用酶编码新基因,并筛选获得了多种符合饲料应用要求的优质酶制剂。例如,来源于中间耶尔森氏菌的高比活植酸酶Y4、适合于猪饲养的植酸酶、适合水产动物应用的中性植酸酶等。这些酶的获得,一方面可以满足饲料工业的各种不同需求,另一方面可加深对酶关键性质与结构功能的了解,指导进一步的分子改良。3.2采用定点突变方法对植酸酶的稳定效果性质优良的植酸酶虽然不容易从自然界中分离,但是随着基因工程和蛋白质工程的发展,现在人们把目光转向植酸酶的蛋白质工程的研究,通过蛋白质工程的手段来改善植酸酶的性质。并且通过该技术结合基因工程的方法,已经成功地实现了部分植酸酶的一个或多个性质的改善和提高。基于植酸酶晶体结构的研究,现在已对植酸酶的作用机理及与特性相关的氨基酸残基有了较为深入的了解。采用定点突变的方法对植酸酶进行改造,可提高E.coli植酸酶的热稳定性,提高A.fumigatus植酸酶的比活,拓展A.niger植酸酶的pH作用范围。根据“一致性”的方法理论,对一系列真菌植酸酶的保守序列进行研究,结合大量的实验,Lehmann等合成了热稳定性好、催化效率高的植酸酶。人们还通过替换不同植酸酶的活性中心来提高比活、热稳定性和最适pH。这些研究都充分证明了通过蛋白质工程的办法来改善植酸酶的性质具有一定可行性,但还需要继续的研究和探索。3.3p.pastoris的研究进展植酸酶作为多种饲料添加剂的一种,决定了它的添加成本必须低廉。为降低植酸酶的生产成本,植酸酶高效表达的研究是必要的。可用的表达系统也是多种多样的,例如,曲霉、木霉、毕赤酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链霉菌等表达系统。其中在植酸酶的高效表达系统中研究的最多的是甲醇营养型酵母表达系统。该系统也是近几年人们重点研究和应用的表达系统,包括Pichiapastoris和Hansenulapolymorpha表达系统。罗会颖等按照P.pastoris密码子的偏爱性,对源于E.coli的高比活植酸酶基因appA进行了密码子优化改造,将改造后的基因融合到P.pastoris表达载体pPIC9上,结果表明:植酸酶得到了高效分泌表达,在5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到2.5mg/mL,大大高于当时报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。按照相似的办法,黄火清等将来源于Citrobacterbraakii的植酸酶在P.pastoris中的表达量提高到了3.2mg/mL。另外,Stretptomyceslividans、Lactobacillusplantarum和Bacillussubtilis等表达系统都可以用于植酸酶的表达。3.4植酸酶的生产转基因植物作为植酸酶的表达系统,有着非常诱人的前景。一方面,转基因植物可以直接表达足够的植酸酶来替代在饲料和食品中添加额外的微生物植酸酶,同时在植物根部表达的植酸酶还可以对土壤进行改良;另一方面,转基因植物也可以作为生物反应器用来生产植酸酶。一些真菌植酸酶,例如A.niger植酸酶,已经成功地在烟叶、大豆、小麦和玉米等植物中得到表达。在烟草中,A.niger植酸酶可以分泌到细胞间隙,并且占可溶性总蛋白的14%,而对植物本身的生长没有任何的影响。在饲喂实验中,转基因大豆生产的植酸酶也能得到和微生物植酸酶相同的效果。目前,细菌来源的植酸酶在植物中也得到了表达,例如,B.subtilis植酸酶在烟草的细胞质中得到表达,E.coli和S.ruminantium植酸酶也成功地在水稻中得到表达。另外,植酸酶基因在小鼠和猪的唾液腺中也得到高效表达。这样可以不用在饲料中添加植酸酶,也不用考虑植酸酶在饲料制粒加工时的高温损失,然而转基因动植物最终是否能够在商业生产中应用,还取决于安全性评估和绿色环保要求的允许。4下一步研究开发植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中,但真正具有开发价值的仅限于利用微生物生产植酸酶,而且真正适合于工业应用的酶必须具备以下特性:具有好的热稳定性,同时在常温下具有高活性;最适pH在酸性,同时在整个酸性和中性的pH范围内又能维持较高活性;对动物胃、胰蛋白酶和别的蛋白酶具有较好的抗性等