lc-msms法测定人血浆中氢氯噻嗪

lc-msms法测定人血浆中氢氯噻嗪

坎地沙坦酯和氢氯仿铵（hydrochrort虞家遗址，1）由坎地沙坦酯和1组成。1为噻嗪类利尿剂,具有利尿、降压作用,坎地沙坦酯是血管紧张素Ⅱ受体抑制剂,两者合用作用增强,临床用于心血管系统疾病的治疗。主要采用HPLC法测定1。本试验采用LC-MS/MS法测定血浆中的1浓度,定量限为lng/ml,方法简捷,适于药动学和药效学研究。1色谱资料和对照品FiniganTSQDiscoveryMax型三重四极杆串联质谱仪(美国热电公司);Xcalibur1.2色谱工作站。坎地沙坦酯1片(批号04091702,每片含112.5mg)、1对照品(纯度>99.0%)和磺胺甲唑(sulfamethoxazole,2,内标)对照品(纯度>99.0%)均为江苏健翔药业有限公司产品;甲醇为色谱纯,盐酸、乙酸乙酯均为分析纯,水为超纯水。2方法和结果2.1对照品贮备液的制备1对照品贮备液:精密称取1对照品10mg,置10ml量瓶中,加甲醇溶解并定容,摇匀,得1mg/ml1对照品贮备液。内标溶液:精密称取2对照品10mg,置10ml量瓶中,加甲醇溶解并定容,摇匀,即得1mg/ml的2贮备液。用甲醇稀释得2μg/ml的内标工作液。2.2质谱条件色谱条件:色谱柱C18柱(4.6mm×150mm,5μm);流动相甲醇-水(50:50);柱温25℃;流速0.7ml/min,进样量10μl。质谱条件:离子源API-ESI源;喷雾电压4000V;雾化气压0.4MPa;辅助气压力0.03MPa;加热毛细管温度350℃;碰撞气压力0.5Pa;碰撞诱导解离CID电压均为25eV;选择性反应离子检测(SIM):m/z296.0→296.0(1)和m/z251.9→251.9(2)。2.3有机相及内标液制备精密量取血浆0.5ml置5ml离心管中,精密加入内标工作液25μl和0.1mol/L盐酸0.1ml,涡旋混匀,加入乙酸乙酯2.5ml,涡旋3min,离心(2700×g)10min。精密吸取有机相2ml置离心管中,50℃水浴下用氮气流吹干。残渣用流动相150μl溶解,取上清液测定。上述操作均需避光。2.4lc-ms/ms分析空白血浆、1和2对照品溶液、空白血浆加1和2、给药后2h血浆样品的LC-MS/MS图谱见图1。1和2的保留时间约为2.2min和2.5min。1和2峰形良好,基线平稳,内源性物质无干扰。2.5标准血浆样品的线性回归分析分别取1对照品贮备液适量,以氮气流吹干,加入空白血浆0.5ml,涡旋1min,配成1浓度分别为1、3、10、20、50、100、200ng/ml的系列标准血浆样品,照“2.3”项下操作后进样测定。以1与2的峰面积比值R为纵坐标,1浓度c为横坐标,进行线性回归,得回归方程R=9.54×10-3c-1.9×10-4,r=0.9980。表明在1～200ng/ml浓度范围,1的线性关系良好。1的定量限为1ng/ml。2.6流动相的测定分别取1对照品溶液适量,用甲醇配成浓度为3、20、100ng/ml的溶液,各10份,取0.5ml,用氮气流吹干,其中5份以流动相150μl溶解残渣,进样测定,记录1的峰面积As。另5份加空白血浆0.5ml,按“2.3”项下方法处理后进样测定,记录1的峰面积Ax。计算介质效应ME(%)=Ax/As×100%,结果分别为110.1%、108.5%、107.1%,表明本法测定1,不受介质效应干扰。2.7内标峰面积比值按“2.5”项下方法制备低、中、高3种浓度(3、20、100ng/ml)的血浆样品,各5份,共3批,按“2.3”项下方法处理后进样测定,结果见表1。取1对照品贮备液适量,用甲醇稀释得1浓度分别为3、20、100ng/ml的溶液,分别取0.5ml,精密加入内标溶液25μl,以氮气流吹干后用流动相150μl溶解残渣,取上清液进样分析,记录色谱图,计算1和2的峰面积比值fs(fs=As/Ai)。另取离心管数支,分别精密加入上述1对照品溶液适量,氮气吹干后加空白血浆0.5ml,涡旋混匀,配成含1浓度分别为3、20、100ng/ml的血样,每种浓度5份,然后按“2.3”项下操作后进样测定,记录色谱图,计算样品和内标的峰面积比值fx(fx=As/Ai)。计算1的提取回收率(R%=fx/fs×2.5/2×100%,其中2.5/2为稀释倍数),结果见表1。2.8冻融稳定性测定取1浓度为3、100ng/ml的含药血浆样品,在室温放置8h、反复冻融3次及在-70℃冻存10d后测定,得RSD(%,n=3)分别为1.3、0.3、1.3和1.5、2.6、0.9。2.9试验组及主要药动学参数试验方案经南京市第一人民医院伦理委员会批准。20名健康志愿者,男女各半(年龄20～25岁,体重55～68kg,身高165～177cm),体检证实心、肝、肾功能正常,试验前2周及试验期间未服用其它任何药物,试验前签署知情同意书。受试者随机分为试验Ⅰ、Ⅱ二组,每组10名,男女各5人,Ⅰ组受试者按A、B……I、J页序编号;Ⅱ组受试者按K、L……S、T顺序编号。单剂量给药方案:I组(12.5mg×1片)和Ⅱ组25mg(12.5mg×2片);多剂量给药方案:I组(12.5mg×1片/天),连续服用6d。受试者于试验前1d和试验期内禁饮用酒、碳酸、咖啡类饮料,试验前禁食过夜至少10h(不禁水)。试验前晚入住Ⅰ期试验室,翌晨空腹服用受试制剂,以温开水250ml送服,服药2h后可再饮水,4h后统一进餐。受试者服药后避免剧烈运动,亦不得长时间卧床。试验期间受试者统一饮食。受试者于服药前及服药后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、11、14、24、36、48h静脉采血约5ml,血样置肝素化离心管中,离心(1540×g)分取血浆,于-70℃冷冻待测。单剂量Ⅰ、Ⅱ组口服坎地沙坦酯1片后的平均药-时曲线见图2,主要药动学参数见表2。10名志愿者多剂量口服坎地沙坦酯1片后d4、5、6的平均谷浓度和药-时曲线见图3,结果表明连续服药4d后血药浓度达稳态,估算的1稳态药动学参数,tmax为(1.83±0.25)h,为(3.72±1.79)ng/ml,cav为(19.37±3.20)ng/ml,波动系数DF为3.93±0.36,累积因子R为1.12,AUC0-48h为(484.90±76.89)h.ng·ml-1。3反相高效液相色谱法1水溶性较强,文献采用固相萃取法富集样品,回收率可达85%以上,但操作繁琐;其它文献均采用液-液萃取法提取血浆中的1,优化条件后,最终选用0.1mol/L盐酸0.1ml酸化血浆后用乙酸乙酯提取,萃取回收率约为70%,血样的处理过程比固相萃取法简单。1极性较强,在C18柱上保留差,出峰时间短,易受内源性杂质峰的干扰,故有文献采用离子对反相高效液相色谱法和正相高效液相色谱法来增强保留,改善峰形,提高分离效率,但分析时间长达10min,且灵敏度不高,定量限为3～l0ng/ml;文献采用毛细管反相高效液相色谱法,样品峰与杂质峰未能基线分离,定量限为5ng/ml。坎地沙坦酯1片中的