魔芋球茎中多酚氧化酶活性及其对褐变的抑制

魔芋球茎中多酚氧化酶活性及其对褐变的抑制

0魔芋粉的应用花甘薯和白甘薯。y.lietj.f.chen）是天南星科白色甘薯属的多年生草本植物。花魔芋主要分布于喜马拉雅山地至泰国、越南,中国从南到北均有分布,并传至日本和菲律宾,为日本和中国的最重要栽培种,其球茎葡甘聚糖含量在55%以上,利用价值很高。白魔芋种为中国所特有,分布于金沙江河谷山区,主要在四川南部及云南北部。白魔芋葡甘聚糖的含量达60%,色泽洁白,质量最佳。花魔芋和白魔芋均是中国两个主要的栽培种。其魔芋粉占中国魔芋粉产量的97%以上。魔芋粉已经广泛应用于现代食品、医药、农业、环保、日化等行业。在鲜魔芋脱水初加工过程中,由于去皮和切片导致组织细胞破裂,使细胞内的化学成分在酶的作用下发生反应,迅速产生褐变,甚至引起黑心,严重降低魔芋干片的商品价值,并影响所加工魔芋粉的外观和商品价值。魔芋粉的白度、黏度和粒度是衡量魔芋粉质量高低的重要指标。为了抑制魔芋在干燥过程中引起的褐变,加工户普遍采用熏硫的方法,既污染环境,又使SO2含量超标,严重影响其在国际市场上的竞争能力。郑莲姬等从理论上对魔芋褐变的可能原因及安全抑制方法进行了分析,并认为抗坏血酸、植酸、半胱氨酸、柠檬酸等因可以螯合酚酶中的铜辅基及降低pH值,可能使酚酶失活从而抑制魔芋褐变。除此以外有关魔芋褐变机理的研究很少见报道。本文以白魔芋和花魔芋为研究材料,通过比较两种魔芋球茎采挖后在室温贮藏过程中的多酚氧化酶活性、褐变强度和总酚含量的变化情况,分析酶促褐变的底物,筛选安全无害的褐变抑制剂。1材料和方法1.1试验材料单个重约1kg的花魔芋球茎50个(来源于四川省万源市);单个重约0.3kg的白魔芋球茎50个(来源于四川省屏山县)。1.2白魔芋和花魔芋多酚氧化酶活性测定2003年11月魔芋采挖后,按每月上、中、下旬定时测定白魔芋和花魔芋多酚氧化酶活性,测到次年1月中旬。比较两种魔芋多酚氧化酶活性、酚类物质含量、褐变强度在室温贮藏条件下的变化。1.2.1抗粗酶活性测定参考毕玉蓉等的方法进行:将鲜魔芋放入4℃冰箱中预冷30min,取出洗净、去皮。取5g魔芋球茎加入5mL磷酸缓冲液(0.05mol/L、pH5.5)冰浴中研磨后,低温下离心20min(12000r/min、4℃),取出上清液后,再加入10mL的磷酸缓冲液重复离心,合并两次上清液于25mL容量瓶中,用磷酸缓冲液定容,即得粗酶液。反应体系中加入1.9mL磷酸缓冲液和1mL0.1mol/L儿茶酚溶液,在37℃下保温10min后,倒入1cm比色皿中,迅速加入0.1mL酶液,记录410nm下的吸光度变化(每30s记录一次吸光值,共记录3min),重复测3次。以最初直线部分的斜率计算酶活力,一个活力单位(U)定义为在测定条件下每1min引起吸光值改变0.001所需的酶量。1.2.2研钵、过滤、过滤参照刘福岭等的4-氨基安替比林法进行,其中酚类物质的提取:取5g魔芋球茎于研钵中,并加入10mL乙醇和1mL10%的三氯乙酸后匀浆,将匀浆液全部转入25mL容量瓶中,用10%三氯乙酸洗涤研钵并定容至刻度,静置30min,过滤,收集滤液于试管中。酚类物质的测定:取滤液1mL,加入5mL试剂1(1gNa2CO3溶于50mL0.1mol/LNaOH溶液中,另将0.5gCuSO4·5H2O溶于100mL1%酒石酸钾钠溶液中,将两种溶液按50∶1的比例混合即为试剂1),混匀,25℃下保温30min,用分光光度计在500nm处测定样品的吸光度,利用标准曲线y=6.7389x-1.033,R2=0.9994即可得到待测样品中酚类物质的含量。1.2.3低温下匀浆中总吸光度的测定参照王清章等的方法:取5g魔芋球茎以1∶10加预冷过的蒸馏水,低温下匀浆2min,过滤后取滤液于25℃保温5min,在波长410nm处测定其吸光值A410,重复测3次,结果以A410表示。1.2.4魔芋球茎褐变的检测参照赵友兴的方法:用紫外分光光度计分别测定多巴胺标样中加入从魔芋球茎中提取的酶液后反应的产物及魔芋球茎褐变产物(魔芋球茎去皮后暴露在空气中引起褐变,取5g褐变的魔芋以1∶10加蒸馏水匀浆2min,过滤后的滤液为褐变产物)在不同波长处的吸光值,并进行紫外吸收光谱对照。初步确定魔芋褐变的底物。1.2.5聚合物苯甲酰胺盐系对甲基缓冲液的吸附参照汪家政等的方法:采用Laemmli不连续系统进行电泳,浓缩胶浓度为4.5%,分离胶浓度为7.5%,在4℃下进行电泳,采用80V预电泳30min,分离胶电泳150V,电极缓冲液用甘氨酸缓冲液系统pH=8.3,溴酚蓝作为指示剂。染色参照王鹏的方法,胶条取出后,立即加入pH7.2的磷酸缓冲液中,4℃下放置5min后,把胶条移至1%的对苯二酚中,37℃下约2h,取出后于空气中放置,酶带显现后,充分水洗,照相并分析比较白魔芋和花魔芋多酚氧化酶带差异。1.2.6抗坏血酸作用根据有关文献和预备试验,把洗净、去皮、切条的白魔芋和花魔芋分别浸泡在不同浓度(表1)的植酸(phyticacid)、L-半胱氨酸(L-Cysteine)、柠檬酸(CitricAcid)和抗坏血酸(AscorbicAcid)溶液中5min,然后放入60℃烘箱中烘烤12h,并对干燥的魔芋条颜色打分比较抑制效果。计分标准为:白有光泽>90,白90~80,灰白80~70,浅黑、微红70~60,黑、特红<60。1.2.7组合抑制剂试验在前期试验的基础上进一步对比较容易褐变的花魔芋PPO采用了四种抑制剂组合进行抑制试验。方法为:将洗净、去皮、切条的魔芋浸泡在L-半胱氨酸+柠檬酸+植酸+VC等不同浓度组合的组合抑制剂溶液中,各处理浓度见表2,5min后,取出沥干水分,其余处理同1.2.6,分析最优组合。2结果与分析2.1魔芋的ppo活力变化从图1可看出,魔芋从采收到11月下旬,PPO活力处于上升趋势;从12月上旬到12月中下旬,PPO活力基本处于下降的趋势;之后魔芋PPO活力又处于上升的趋势。在整个储藏过程中,随着贮藏时间的变化,两种魔芋PPO活力的变化趋势基本一致,且白魔芋的PPO活力始终弱于花魔芋PPO活力。这种现象可能跟魔芋贮藏期的生理活动有关。魔芋球茎在贮藏期的生理过程大致分为四个阶段,即后熟期、休眠期、休眠解除期和芽伸长期。从采收到12月上旬之前是魔芋的后熟期,期间球茎含水量高,且伤口呼吸作用及蒸发作用较强,内部代谢旺盛,各类酶的活性较强,所以魔芋多酚氧化酶的活力,在这段时间会上升。12月上旬到12月中旬或下旬的魔芋的逐渐进入休眠期,此期间,球茎呼吸作用减弱,球茎内部生理代谢不旺盛,各类酶的活性较低,所以魔芋PPO活力处于下降趋势。12月中下旬以后是魔芋的休眠解除期,此期间呼吸作用仍很弱但多酚氧化酶的活性随着休眠的解除略有上升,魔芋PPO活力处于上升趋势。2.2魔芋总酚类物质的变化图2中可以看出,魔芋从上年11月初采挖到次年一月上旬,贮藏过程中魔芋中的总酚类物质处于上升趋势,而且在同一时期白魔芋的总酚含量始终比花魔芋的总酚含量高。2.3魔芋的褐变强度从图3中可以看出,从采收到11月下旬为止,两种魔芋褐变强度处于上升的趋势,从11月下旬到12月下旬为止,魔芋的褐变强度处于下降的趋势,从12月下旬开始魔芋褐变强度又处于慢慢上升的趋势。整个贮藏过程中,白魔芋的褐变强度弱于花魔芋的褐变强度。这个趋势跟花、白魔芋贮藏期间的PPO活力的变化趋势是一致的,说明魔芋的褐变程度跟魔芋PPO活力呈正相关,而与总酚含量关系变化无关。2.4魔芋和花魔芋引起褐变的底物从图4、5可看出,白魔芋和花魔芋多酚氧化酶以多巴胺为底物时,吸收光谱最大吸收峰值在300nm附近;白魔芋和花魔芋自然褐变产物的吸收光谱最大吸收峰值也在300nm附近,说明白魔芋和花魔芋引起褐变的底物可能都是多巴胺。目前国内外对苹果、梨、香蕉、马铃薯、莲藕、荔枝等果蔬多酚氧化酶作用的底物方面有很多研究报道,有关底物主要有绿原酸、儿茶素、表儿茶素、没食子酸、邻苯二酚、阿魏酸等。但对魔芋褐变方面的研究报道很少,仅有Tono等从花魔芋球茎中分离得到了一种含酚环的含氮衍生物及3,4-二羟基苯乙胺(多巴胺),认为多巴胺是魔芋的褐变物质。本试验结果也倾向于多巴胺。2.5白魔芋的酶从图6可看出,白魔芋和花魔芋的多酚氧化酶电泳谱带均出现在同一个水平线上,说明白魔芋和花魔芋引起褐变的酶都是多酚氧化酶,但花魔芋的酶带比白魔芋的酶条带细,这说明同量的白魔芋引起褐变的酶含量多于花魔芋的酶量。联系2.1和2.3的试验结果花魔芋的褐变强度又远远高于白魔芋的褐变程度,再次说明魔芋的褐变程度跟所含的酶量不是呈正相关,而是与酶活力呈正相关。2.6不同浓度的添加剂对两种侄子的褐色变化抑制有效2.6.1ph值对白魔芋烘烤的影响从表2可以看出,当L-半胱氨酸浓度为0.005%以上,植酸浓度达到0.5%以上,柠檬酸浓度为3%以上时,白魔芋的烘烤效果达到较佳状态,颜色计分达90分以上。考虑pH值过低对产品黏度的不利影响和成本因素,因此采用0.01%的L-半胱氨酸单因素对白魔芋的褐变抑制效果达93分,效果最好。抗坏血酸浓度越高对白魔芋的烘烤效果反而下降,可能是浓度过高引起抗坏血酸自身氧化的结果。2.6.2抗坏血酸浓度对花魔芋烘烤效果的影响从表2可以看出,对花魔芋褐变抑制总体效果较差,但其中仍然以L-半胱氨酸为较好,当L-半胱氨酸浓度为0.5%以上时,烘烤效果才达到70分以上。当植酸浓度为3%时,最高为62分;当柠檬酸浓度为3%时,最高为87分;抗坏血酸浓度越高花魔芋的烘烤效果反而下降。由表2可知,对两种魔芋烘烤效果最好的是L-半胱氨酸处理,其中用0.01%的浓度处理白魔芋可达到98分的效果,而花魔芋需要0.5%的浓度处理才达到70分的效果。因此采用0.01%的L-半胱氨酸单因素处理对白魔芋即可达到满意的褐变抑制效果。对花魔芋需要进一步进行多种组合抑制剂的试验。2.7正交试验结果由表3可知,L-半胱氨酸、柠檬酸、植酸、抗坏血酸四组分组合抑制剂对烘烤效果的主次因素为A>B>D>C,即L-半胱氨酸>柠檬酸>抗坏血酸>植酸,试验结果最优组合为A2B1C1D1,即L-半胱氨酸浓度0.15%,柠檬酸浓度1%,抗坏血酸浓度0.01%,植酸浓度1%,验证实验评分值为93.5,也进一步证实了该组合为最佳组合。3魔芋贮藏期间总酚含量的变化1)魔芋从采收到11月下旬,PPO活力处于上升趋势;从11月下旬到12月中旬或下旬,PPO活力处于下降的趋势;之后魔芋PPO活力又处于上升的趋势,且花魔芋的PPO活力始终强于白魔芋的PPO活力。在贮藏过程中魔芋中的总酚类物质处于上升趋势,其中白魔芋中的总酚含量始终高于花魔芋。魔芋贮藏期间的褐变强度跟魔芋中的PPO活力的变化趋势是一致的,说明