基于分子遗传学的智能低下多系诊断方法

基于分子遗传学的智能低下多系诊断方法

脆x综合征（mim:309550）是一种罕见的遗传智能低下综合征，不同于先天愚蠢。发病率为0.05%，是x连接遗传因素的40%。其外显率因性别不同有差异,男性80%,女性30%。95%以上的脆性X综合征患者发病的分子遗传学基础是FMR1基因(CGG)n结构扩展的动态突变引起的,约5%以下则是由于FMR1基因的错义突变和缺失型突变影响了FMRP的正常结构导致的。FMR1基因位于染色体Xq27.3,在基因组序列约38kb,由17个外显子和16个内含子组成,编码脆性X智能低下基因蛋白(FMRP)。FMR1基因是一个高度保守的基因,其5′端外显子上的非翻译区有一个(CGG)n三核苷酸串联重复序列,(CGG)n在重复片段长度和AGG嵌入模式上都存在多态性,并且可以遗传,在其上游大约250bp处有一个CpG岛。正常FMR1基因(CGG)n中n介于7～60之间。当n扩展到60～200时,携带者虽表型正常,但在传代过程中易发生进一步扩展,称FMR1基因的前突变。前突变CpG岛一般不甲基化,FMR1基因具有相对正常的转录和蛋白质水平,不表现出临床症状。当n扩展达200以上时,男性100%表现为典型的脆性X综合征,女性也有30%～50%表现轻重程度不等的智能低下。这种FMR1基因的突变称全突变,前突变至全突变的扩展是严格母系的,全突变(CGG)n重复序列大量扩展,引起FMR15′(CGG)n侧CpG岛异常甲基化,使FMR1基因失活,导致FMRP的缺失引起智能低下。脆性X综合征发病率高,临床表现复杂,遗传规律独特,目前无有效的治疗方法,要降低其发病率,关键是查出携带者及病人,然后通过遗传咨询、产前诊断、阻止患儿出生。本文采用PCR与RT-PCR相结合的方法,探讨简便、快速、准确、价廉的脆性X综合征基因诊断与产前诊断方法。1材料和方法1.1材料表面6个智能低下家系17个成员的外周血(肝素抗凝)或淋巴细胞株。家系见图1。1.1.2rexctinfirs公司的纺粘设备总RNA提取TRIzol试剂盒购自GIBCOBRL公司,ReverseTransiptionSystemKit购自Promega公司。1.2实验方法1.2.1细胞遗传分析按文献的方法完成。1.2.2y基因pcr检测以CB0049脐血gDNA为模板,进行SRY基因PCR扩增;应用X染色体DMD基因内部3CA、44CA、45CA、49CA、50CA、5对CA重复序列对C家系进行连锁分析。1.2.3pcr扩增和回复突变试验酚氯仿法提取gDNA。根据Fu等在FMR1的(CGG)n两侧设计1对引物(FMR1-1/FMR1-2),进行PCR扩增,扩增片段长度308bp(29CGG)。PCR反应总体积为20μL,包括gDNA2μL(100ng/μL),引物FMR1-1、FMR1-2各0.6μL(100ng/μL),10×PCR缓冲液2μL(100mmol/LTris-HClpH8.3,500nmol/LKCl,15mmol/LMgCl2),dNTP0.6μL(每种10mmol/L)和DMSO2μL。前突变和全突变的扩增dGTP改用dGTP:7-deaza-dGTP=1/3。反应条件:⑴扩增正常的等位基因98℃变性10min后加Taq酶0.2μL(5U/μL),然后(97℃30s;65℃30s;68℃30s)扩增30个循环,最后在72℃延伸10min。⑵扩增前突变和全突变等位基因98℃变性10min后加Taq酶0.2μL(5U/μL),然后(97℃30s;65℃45s;68℃4min)扩增10个循环,接下来(97℃30s;65℃45s;68℃4min20s)扩增20个循环,最后在72℃延伸10min。PCR扩增所用Taq酶购自TakaRa公司。反应是在PerkinElmer9600PCR仪。PCR产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染检测。如有非特异性条带则用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,以消除构象带。1.2.4巢式pcr检测用TRIzol提取血细胞总RNA。根据Verkerk等报道的FMR1基因cDNA序列,并参照Pai的报道,设计合成了2对引物fnet1、fnet2、fnet3、fnet4。序列见表2。根据Gibbs等的报道合成了2对引物作为内对照,用来检测位于X染色体上的HPRT基因的转录产物,命名为fcon1、fcon2、fcon3、fcon4。其序列见表1。用ReverseTranscriptionSystem(Promegacat#A3500)将RNA转录成cDNA。巢式PCR第一轮使用引物fnet1、fnet2、fcon1和fcon2。第二轮使用引物fent3、fnet4、fcon3和fcon4。PCR反应总体积为20μL,包括cDNA1μL(100ng/μL),fnet引物各0.6μL(100ng/μL),fcon引物各0.4μL(100ng/μL),10×PCR缓冲液Mg2+Free2μL(100mmol/LTris-HClpH8.3,500mmol/LKCl),Mg2+1.2μL(25mmol/L),dNTP0.6μL(每种10mmol/L),Taq酶0.2μL(5U/μL)。反应条件:94℃变性10min,然后(94℃30s;58℃20s;72℃30s)扩增20个循环,最后在72℃延伸10min。PCR扩增在PE9600型PCR仪上,二轮PCR条件一样。PCR产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染检测。2结果2.1细胞遗传结果2.1.1a家族先证者(B2260),脆性X染色体检出率35/273,诊断为脆性X综合征患者。2.1.2b家族先证者(B7042)及其母亲(B7043)均未发现脆性X染色体,诊断为非脆性X综合征患者。2.1.3脆性x综合征检测胎儿脐血扩增出SRY基因;连锁分析胎儿脐血无母血污染;先证者(M3045)及其母亲(M3016)未发现脆性X染色体,男性胎儿(CB0049)脆性X染色体检出率5/93,可疑为脆性X综合征家系。2.1.4d家族先证者(B7054)脆性X染色体检出率17%;其姐姐(B7055)脆性X染色体检出率5%,诊断为脆性X综合征家系。2.1.5e家族先证者(M2999)发现脆性X染色体2%,母亲(M2998)发现脆性X染色体4%,诊断为脆性X综合征家系。2.1.6f系先证者(M3003)发现脆性X染色体3%,母亲未发现脆性X染色体,父亲(M3001)发现脆性X染色体1%,可疑为脆性X综合征家系。2.2pcr扩增fmr1基因PCR直接扩增FMR1基因(CGG)n重复序列与RT-PCR扩增FMR1基因cDNA序列联应用,对6个智能低下家系进行分析,B、C家系PCR扩增FMR1基因的结果见图2;A、C、D家系RT-PCR扩增FMR1基因cDNA的结果见图3;分子遗传学检测及诊断结果见表2。3pcr扩增内镜细胞遗传学的脆性部位FRAXA(Xq27.3)是FMR1基因突变的一个直接的细胞学标记,是与CGG重复相一致的,这是因为(CGG)n大量扩展和甲基化干预了DNA的复制和染色质缩合,但是脆性X染色体并不是在所有的中期细胞中都能检测到,其表达范围低的不到1%,高的可达80%。且FRAXA附近存在多个脆性位点[FRAXE(Xq28)、FRAXF(Xq末端)、FRAXD(Xq27.2)、还有Xq26],以上这些脆性位点对于细胞遗传学工作者,尤其是经验不足者,有时是很难区分的。本研究结果表明,细胞遗传学检查只能对有明显脆性X综合征临床表现,又有脆性X染色体高表达的病人做出诊断。对脆性X染色体低表达的病人及携带者(如C、E、F家系)的诊断有明显的假阳性和假阴性,单独用于脆性X综合征的诊断易造成误诊和漏诊。1991年Verkerk等在Xq27.3附近发现了脆性X智能低下基因(FMR1),使脆性X综合征的诊断可以通过DNA进行分析。分子诊断一直以Southern印迹杂交为主,目前认为用较远侧探针(StB12.3)对双酶解(如EcoRI/EagI)DNA样本进行杂交,可检出全部前突变和全突变等位基因,同时可了解CpG岛甲基化状态,是最可靠的诊断方法。然而这个技术是很繁琐、费时、昂贵,需要大量gDNA,对于前突变的检测不准确,检测甲基化时,要求等位基因被甲基化比例高于一定值才能被灵敏检测,而且要求甲基化CpG岛包含在限制性内切酶的识别序列之内。操作时必须注意酶解完全,酶解不完全时,产生的杂交带可导致错误的诊断。该方法有大约5%的误诊率,既有假阳性,更常见有假阴性结果。近年来,发展了PCR序列特异性寡核苷酸探针杂交(Sequencespecificoligonucleotideprobehybridization,SSOPH)技术,即用PCR直接扩增(CGG)重复系列,凝胶分离后转移至膜上,用放射性或非放射性标记的(CGG)5寡核苷酸探针杂交放射自显影或化学萤光显影暴光X光片。但此技术操作繁琐,费用大,扩增(CGG)高拷贝的前突变及全突变存在扩增抵抗。应用PCR扩增(CGG)n重复序列,根据扩增片段的长度直接检测CGG的拷贝数,进行基因诊断。但扩增的部分CG含量极高,在前突变和全突变CG含量更高,且患者(CGG)n重复序列过长,易形成稳定的二级结构,PCR扩增时变性不完全,扩增效率低,CG重复次数较多的片段一般PCR很难扩出。我们使用高变性温度(98℃10min)使模板充分解链,接下来通过热启动程序,提高Taq酶的活性,用递降PCR(touchdownPCR)来提高PCR扩增的特异性,PCR反应体系中加入10%DMSO有利于模板的解链。以7-deaza-dGTP代替部分dGTP(前者与后者比为3/1),使CG之间形成两个氢键,以降低Tm值。通过以上的方法,扩增正常等位基因能达到高PCR产量,且重复性好。同时也扩增出了一个CGG重复拷贝90左右的前突变,我们还比较了扩增正常等位基因时,应用与不应用7-deaza-dGTPPCR效率无区别,应用与不应用递降PCR,扩增效率也无区别,关键是要有一个高的变性温度和热启动PCR。扩增效率与引物有关,远离(CGG)n重复部位的长引物扩增效率高。但是扩增(CGG)高拷贝的前突变及全突变仍存在扩增抵抗。RT-PCR,从RNA角度检测脆性X综合征患者。Piaretti等报道绝大多数脆性X综合征男性患者无FMR1基因表达,而女性患者的FMR1基因是杂合的,FMR1基因表达有某些程度的降低,但总能检测到FMR1基因的表达,所以RT-PCR在男性患者及因非动态突变缺失型缺乏FMRP的个体是检测不到cDNA产物的,女性患者可检测到产物。那些少数由非甲基化传递的前突变与甲基化全突变细胞构成的嵌合体患者及极少数由于点突变造成的患者也能检测到FMR1基因的表达。我们采用套式PCR提高检出敏感性,同时还对每次PCR做一空白对照,并引入内对照引物,确保了结果的可靠性。本研究将PCR直接扩增FMR1基因(CGG)n重复序列与RT-PCR扩增FMR1基因cDNA序列联合应用,对6个智能低下家系进行了基因诊断,整个实验在采集样本后24h内完成,对于实验来说,纳克(10-9克)数量级的DNA/RNA是非常充足的,产前样本也可直接进行研究,两种方法相互印证,互相补充,克服了单独应用PCR或RT-PCR的局限性,较经典的Southern印迹杂交精确,价廉,快速,实验