黄豆酱活性干酵母的制备

黄豆酱活性干酵母的制备

在生产豆腐酶时，母菌的参与是必不可少的。在酱醪的中后期,酵母菌优势越来越明显,其主要作用是发酵糖类物质产酸产醇,并与乳酸菌的代谢产物发生反应,形成特殊的酱香成分,这是酱类制品呈味的主要途径。目前从酱醅中分离出来的酵母菌有7个属23个种,其中对豆酱风味具有重要作用的耐盐性酵母有鲁氏酵母、球拟酵母等。据有关资料报道,耐盐性鲁氏酵母在豆酱发酵中不仅产生乙醇、异戊醇、异丁醇等醇类物质,并且在高盐状态下使糖类生成多元醇,即丙三醇、阿拉伯糖醇、赤藓糖醇等糖醇类风味物质。而球拟酵母在发酵过程中还能生成与黄豆酱香气有关的4-乙基愈创木酚、4-乙基苯酚、呋喃酮等。近几年酱制品行业得到稳步的发展,国内已经实现工业化,但是大多数企业仅仅利用曲霉发酵,酱的生产周期虽缩短到28d,可是生产出的酱风味不如传统发酵的酱。国内针对用酵母菌增进豆酱和酱油风味的研究已屡见不鲜,但仍未开发出应用于酱制品行业的酵母发酵剂,所以大部分制酱企业还不能将酵母菌应用到生产中。因此开发出利于工业化生产黄豆酱的酵母发酵剂对于制酱企业来说已不容忽视。目前,国内针对活性干酵母的研究已有诸多报道,但大多是对于酿酒、面包干酵母的研究,对可发酵黄豆酱的活性干酵母的研究还是空白,因此本文针对利于发酵黄豆酱的鲁氏酵母和球拟酵母的干酵母制备工艺进行研究,开发出可用于黄豆酱生产的活性干酵母,对工业化生产黄豆酱具有指导意义。1材料和方法1.1苏-空气工程鲁氏酵母KFRI216、白色球拟酵母KFRI312哈尔滨工业大学食品学院保藏;酱油培养基生酱油20%、葡萄糖7%、硫酸铵0.5%、硫酸镁0.05%、K2HPO40.05%,用蒸馏水定容至1000mL,调至pH3.5。HZQ—F160A高低温恒温振荡培养箱、恒温干燥箱上海一恒科技有限公司;SW-CJ净化工作台、OLYMPAS生物显微镜苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;TGL-16G压盖冷冻离心机北京博医康实验仪器有限公司。1.2实验方法1.2.1工艺酵母菌的扩大培养→离心收集菌体→菌体的洗涤→干燥保护剂的选择→低温干燥→成品1.2.2活菌数对培养酱油培养基的影响经斜面培养的鲁氏酵母菌和球拟酵母菌分别接种于100mL生酱油培养基中,在25℃下培养,当活菌数分别达到1.0×1011个/mL和1.5×1011个/mL左右时,以5%接种量接种于2L生酱油培养基中,在25℃下培养30h。1.2.3离心温度及菌菌体通过离心方法,收集达到对数生长期的酵母菌菌体,离心温度为4℃。以离心损失率为评价指标,分别确定离心机转数为4000r/min和5000r/min时的离心时间。1.2.4离心收集菌体的清洗用不同浓度(0%、1.5%、2.0%、2.5%、3%、3.5%)的氯化钠溶液对离心收集的菌体进行洗涤。菌体干燥后通过45倍酵母质量的麦芽汁在36℃条件下复水15min,活化120min,测定各条件下酵母细胞的损失率,确定最佳洗涤液浓度。1.2.5保护剂最佳配比的确定实验采用山梨醇单硬脂酸酯(SorbitanMonostearate),别名司盘60(Span60),与土温80以不同质量比例相配比,用无菌水混合作为干燥保护剂,以2%的添加量加入到菌体悬浮液中,干燥后复水活化,以细胞损失率为评价指标,确定保护剂的最佳配比。1.2.6干燥温度的确定分别选择在30、35、40、45、50、55℃条件下对菌体进行干燥,经复水活化后,以细胞损失率为评价指标,确定最佳的干燥温度。1.2.7关于母乳喂养率的研究通过以上设定参数对两株酵母菌进行干酵母的制备,得到的产品经过复水活化分别计算细胞总数、活细胞数及存活率。2结果与讨论2.1心转数对酵母菌得率的影响在不同的离心条件下,酵母菌细胞的离心损失率如表1所示。从表1看出,鲁氏酵母和球拟酵母在离心转数为4000r/min时,两株菌的离心损失率均随着时间的增加而降低,在离心转数为5000r/min时的离心损失率与4000r/min相比总体上要有一定的降低,菌体的得率相对较高。项锦欣在制备橄榄菜发酵剂的研究中表明,通过4000r/min,15min的离心条件收集Sc酵母菌体即可达到收集的目的。但在本实验中两株酵母菌均在5000r/min下的得率较高,所以选择5000r/min的离心转数。在5000r/min条件下30min与20min相比损失率变化不大,但长时间的离心对菌体的存活率有一定的影响,因此选择5000r/min,离心20min为鲁氏酵母及球拟酵母的最佳离心条件。2.2氯化钠液中改性酵母细胞的活性用不同浓度氯化钠溶液洗涤后的酵母,其干燥后的细胞损失率见表2。由表2可以看出,随着氯化钠浓度的增加,两株酵母细胞的损失率降低明显。原因在于酵母干燥过程中细胞迅速脱水,细胞内物质的浓度迅速提高,在渗透压的作用下,酵母细胞膜受到损伤,细胞内物质便大量流失,从而影响酵母的活性。若在酵母悬浮液中加入适量的氯化钠,使胞外渗透压增加,此时酵母细胞可适应干燥时的迅速脱水,酵母细胞壁收缩和细胞脱水的变化比较平稳,细胞膜的损伤较小,同时酵母的活性也得到了保护。通过实验得到2.5%~3.5%的氯化钠溶液的洗涤过程均可使两株酵母细胞在干燥过程中的损失率降到较低程度。一定浓度的盐水洗涤可增加酵母菌体的发酵力,因此本实验选择2.5%的氯化钠溶液对鲁氏酵母和球拟酵母进行洗涤。2.3不同保护剂合理使用的情况下细胞的均能发挥保护作用添加不同配比保护剂的酵母,其干燥后的细胞损失率见表3。由表3可以看出,在单独添加土温80和司盘60的情况下,酵母细胞损失率达到最大。这是由于司盘60在常温下为固态,单独添加时,由于其与酵母泥不能较好地混合,所以保护剂不能充分地包裹酵母细胞,起不到一定的保护作用。而单独添加土温80的情况下,同样不能起到保护酵母细胞的作用。而在司盘60与土温80相互混合的情况下,各比例的细胞损失率均低于二者单独使用的情况,说明二者混合后均能分别与鲁氏酵母和球拟酵母充分混合,并包裹菌体细胞,防止了菌体干燥过程中关键蛋白质的变性及代谢过程中重要的酶失活和脂质体的失效,起到了明显的保护作用。同时保护剂的使用改变了菌体原来的物理状态,形成薄分子层及均质状态的分散体系,进而在细胞周围形成保护膜,提高菌体耐渗透的能力,阻碍细胞内物质的流失,从而减少干燥和复水过程中活性损失。实验结果表明,当二者比例为1∶1时,鲁氏酵母和球拟酵母干燥后的细胞损失率均降到最低,确定司盘60与土温80的比例为1∶1。2.4温度对酵母细胞损失率的影响本实验考查了不同干燥温度对鲁氏酵母和球拟酵母的细胞存活率的影响,结果如表4。表4的结果表明,在干燥过程中,随着干燥的温度不断地升高,鲁氏酵母和球拟酵母的细胞损失率均呈升高的趋势,此结果说明温度对活性干酵母有一定影响,温度越高,菌体细胞的耐受性越低。干燥温度为45℃以上时,两株酵母细胞均不同程度地受到损伤,损失率均大大增加。但在干燥温度为30、35、40℃条件下,两株酵母菌的细胞损失率基本在较低的状态,且大致相同,结果说明30、35、40℃的温度范围对鲁氏酵母和球拟酵母的细胞破坏程度较小,但干燥温度过低时,干燥的时间也较长,能耗较大,成本也大大增加。所以,选择干燥温度为40℃。2.5活性干酵母的制备工艺干酵母经过复水活化计算细胞总数、活细胞数及存活率,结果见表5、表6。由表5、表6可以看出,通过对活性干酵母制备工艺的参数优化,经复水活化后的鲁氏干酵母和球拟干酵母最终得到的活细胞数分别为1.557×1011个/g和1.559×1011个/g,细胞存活率分别为91.7%±0.0103%和91.07%±0.005%。目前国内活性干酵母的研究报道屡见不鲜,但多为复水活化条件的研究,得到干酵母的细胞存活率普遍在86%~90%之间。本实验在对这两株酵母菌进行富集培养的前期工作基础上,对其干酵母的制备工艺进行研究,得到了存活率相对较高的活性干酵母。因此,说明此制备工艺较适合于鲁氏酵母和球拟酵母。3司盘60与土温80比例的干燥本实验针对两株适于发酵黄豆酱的鲁氏酵母和球拟酵母的干菌粉制备工艺进行研究,得到两株酵母菌