流式细胞术分选嗜碱性粒细胞的研究

流式细胞术分选嗜碱性粒细胞的研究

近年来的结果表明，嗜碱颗粒在过敏反应中发挥着重要作用，是过敏炎症的作者和传播者。嗜碱性粒细胞占外周血白细胞的小部分(<1%),提纯一定数量的嗜碱性粒细胞就需要较多的血,这限制了对它的深入研究。脐带血的血量较多,可得到50～150mL的量,并且脐带静脉血相当于新生儿血。本文采用流式细胞术分选提纯产妇脐带血嗜碱性粒细胞,以期得到研究过敏性疾病发病机制的理想标本。1材料和方法1.1资产采集,采集带血新生儿娩出后,用血管钳钳夹离婴儿端约3cm处的脐带,将针头插入脐静脉,抽取脐带血,于产后10min内采集完毕。共收集足月产妇脐带血6份。1.2细胞数据的提取脐血每10mL加1mL0.1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂抗凝,按5∶1的比例加入6%葡聚糖,混匀,37℃水浴30min,沉淀红细胞,吸出含丰富白细胞的上清液,离心,用含10mmol/LEDTA、pH值为7.2的0.01mmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)洗1次,悬浮细胞。1.3胺及含融资日白的制备试管中依次加入1.065g/mLFicoll-泛影葡胺及上述白细胞混悬液各4mL,4℃离心30min。离心后吸出上层细胞,用含10mmol/LEDTA、pH值为7.2的0.01mmol/L的PBS洗2次。1.4fcr荧光微球检测细胞形态密度梯度离心所得的细胞加入PBS、EDTA和0.5%BSA,在4℃的环境中放置20min。每1×107个细胞中加入80μLPBS、EDTA和牛血清白蛋白试剂(BSA),20μLFc受体阻断试剂(FcRBlockingResgent),10μLCD203c-PE和10mLCD45-PerCP免疫荧光抗体标记20min。分离前用Flow-Check荧光微球校准仪器,标本上机后,以前向角散射光(forwardscatter,FSC)和侧向角散射光(sidescatter,SSC)参数观察细胞形态,选取SSC低信号细胞。CD203c-PE+、CD45-PerCPint的细胞即为嗜碱性粒细胞。1.5爱酸性粒细胞染色的计算细胞经阿利新蓝染色并计数,统计其纯度及回收率。细胞经台盼蓝染色,观察其活性。2嗜碱性细胞纯度脐带血葡聚糖沉淀红细胞后嗜碱性粒细胞纯度为(0.26±0.17)%,细胞回收率为(90.08±1.04)%。经Ficoll-泛影葡胺分离后嗜碱性粒细胞纯度为(2.97±0.36)%,细胞回收率为(75.43±1.99)%。流式细胞术分选后嗜碱性粒细胞纯度为(95.02±2.94)%,回收率为(61.42±5.95)%。见表1。台盼蓝染色显示细胞活性为(99.24±0.57)%。3因子分析方法步骤由于嗜碱性粒细胞在血中所占比例低,且缺乏令人满意的纯化方法,故在很大程度上束缚了对它的深入研究。许多研究都利用细胞株KU812,它最先是从慢性髓性白血病患者中获取并建立起来的。KU812是一种未成熟的嗜碱性粒细胞前体,被作为嗜碱性粒细胞分化的模型。有研究表明,IgE并不能诱导KU812的细胞内信号发生,如酪氨酸磷酸化和钙离子释放。Aumüller等发现,嗜碱性粒细胞释放白细胞介素(IL)-4的活性在很大程度上受储存条件的影响,因为它与人原始嗜碱性粒细胞的形态和功能有根本的区别,故细胞株KU812不适用于过敏反应启动机制的研究。脐带血中的免疫细胞尚未直接受到外界过敏原的刺激,是研究过敏反应启动机制的较好材料。脐带血成分较外周血复杂,有未成熟的细胞,其表面标志可能不同于成熟细胞,所以脐带血细胞的纯化方法可能不同于外周血。采用磁珠负性选择和密度梯度离心相结合的纯化方法,从外周血可以得到高纯度的嗜碱性粒细胞。国外资料显示,嗜碱性粒细胞的纯度为(97.60±3.96)%,回收率为(49.7±15.6%)。此外还有去除红细胞后用磁珠负选法,Gibbs等得到的嗜碱性粒细胞纯度为(99.34±0.88)%,回收率为75.6%。但这些方法对脐带血中嗜碱性粒细胞的纯化效果没有外周血理想,因为脐带血成分不同于外周血,有较多的未成熟的细胞,负性选择可能得到不少杂细胞。在分离嗜碱性粒细胞的试剂盒中有人类白细胞抗原(HLA)-DR基因分型试剂(HLA-DR)抗体,外周血嗜碱性粒细胞HLA-DR是阴性的;而脐带血有未成熟的嗜碱性粒细胞,其HLA-DR是阳性的,约占总嗜碱性粒细胞数的59%,采用此方法将丢失这部分细胞,降低回收率。我们曾用抗凝脐血30～50mL,先以6%葡聚糖沉淀红细胞,获取白细胞,进而用Ficol1-Hypaque作密度梯度离心获得3层细胞,上层即为初步纯化的嗜碱性粒细胞,最后采用结合CD2+、CD14+、CD16+和CD19+单抗的免疫磁珠,通过阴性选择方式纯化嗜碱性粒细胞,其平均纯度为75.8%,回收率为81.5%。Reimer等用IL-3刺激培养脐带血21d,诱导未成熟嗜碱性粒细胞成熟,再通过两步法磁珠负选,得到脐带血嗜碱性粒细胞的纯度为(95.0±0.5)%,回收率为(59.0±1.5)%,但操作耗时复杂。这就期望建立简便的方法来获得脐带血中高纯度、高回收率的嗜碱性粒细胞。有学者曾用流式细胞术选取CD123+HLA-DR-的细胞即为嗜碱性粒细胞,但这也是用于外周血。而在脐带血中有未成熟的嗜碱性粒细胞,使用此方法将丢失这部分HLA-DR+细胞,回收率降低约35%。还有作者提出先用磁珠分选去除其他细胞,提高嗜碱性粒细胞的比例后,再用流式细胞术分选。理论上结合了两种分选法可以得到更好的结果,Willheim等取350～450mL外周血用1.077Ficoll-Pague初分后,采用免疫磁珠负选法去除CD14+的细胞,再用流式细胞术分选CDw17+CD14-的细胞即为嗜碱性粒细胞,纯度为(99.5±0.4)%,但回收率仅为8%～25%。近期文献未见结合两种方法来纯化嗜碱性粒细胞的报道,这可能是去除了绝大多数的阴性细胞,反而在用流式细胞术分选时缺乏参照而难以定位。CD203c是新近发现的嗜碱性粒细胞的表面标志,它也可表达在未成熟嗜碱性粒细胞、未成熟和成熟的肥大细胞表面。脐带血中可能会存在肥大细胞,而肥大细胞因与嗜碱性粒细胞的生理功能相似,故需要去除,以免影响实验结果。由于肥大细胞不表达CD45,因此分选CD203c-PE+、CD45-PerCPint的细胞即为嗜碱性粒细胞。国内外至今尚未见以此法纯化脐带血中嗜碱性粒细胞