第三章细胞生物学研究方法选编课件

第三章细胞生物学研究方法

细胞形态结构的观察方法

细胞组分的分析方法

细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞生物学CellBio第三章细胞生物学研究方法细胞形态结构的观察方法细胞生第一节细胞形态结构的

观察方法

光学显微镜技术（lightmicroscopy）

电子显微镜技术

(Electromicroscopy)

扫描探针显微镜（ScanningProbeMicroscope）

扫描遂道显微镜

(scanningtunnelingmicroscope)

细胞生物学CellBio第一节细胞形态结构的

观察方法第二节细胞组分的分析方法

离心分离技术

细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法

特异蛋白抗原的定位与定性

细胞内特异核酸的定位与定性

放射自显影技术

定量细胞化学分析技术细胞生物学CellBio第二节细胞组分的分析方法离心分离技术第三节细胞培养、

细胞工程与显微操作技术

细胞的培养

细胞工程细胞生物学CellBio第三节细胞培养、

细胞工程与显微操作技术细胞的培养一、光学显微镜技术

（lightmicroscopy)

普通复式光学显微镜技术

荧光显微镜技术

激光共焦扫描显微镜技术

相差显微镜

微分干涉显微镜

录像增差显微镜技术细胞生物学CellBio一、光学显微镜技术

（lightmicroscopy)

二、电子显微镜技术

电子显微镜的基本知识

电镜与光镜的比较

电镜与光镜光路图比较

电子显微镜的基本构造

主要电镜制样技术

负染色技术

冰冻蚀刻技术

超薄切片技术

电镜三维重构技术

扫描电镜细胞生物学CellBio二、电子显微镜技术 电子显微镜的基本知三、扫描遂道显微镜ScanningProbeMicroscope,SPM(80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器)

包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。

装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。

特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； （2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；（3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。 （4）可连续成像，进行动态观察

用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。细胞生物学CellBio三、扫描遂道显微镜ScanningProbeMicr普通复式光学显微镜技术

光镜样本制作分辨率是指区分开两个质点间的最小距离细胞生物学CellBio普通复式光学显微镜技术细胞生物学CellBio荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）

原理与应用

直接荧光标记技术

间接免疫荧光标记技术

在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用

细胞生物学CellBio荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscop激光共焦扫描显微镜技术

（LaserScanningConfocalMicroscopy）

原理

应用： 排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重构样品的三维结构。细胞生物学CellBio激光共焦扫描显微镜技术

（LaserScanningCo

相差显微镜（phase-contrastmicroscope）将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞

微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope） 偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器

录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动细胞生物学CellBio相差显微镜（phase-contrastmicrosco电镜与光镜的比较

显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差细胞生物学CellBio电镜与光镜的比较显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LM20电镜与光镜光路图比较细胞生物学CellBio电镜与光镜光路图比较细胞生物学CellBio电子显微镜的基本构造细胞生物学CellBio电子显微镜的基本构造细胞生物学CellBio主要电镜制样技术

超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图

负染色技术（Negativestaining）与金属投影 染色背景，衬托出样品的精细结构

冰冻蚀刻技术（Freezeetching）（技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术（quickfreezedeepetching）

电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）

——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。

细胞生物学CellBio主要电镜制样技术超薄切片技术用于电镜观察的样本制备扫描电镜

原理与应用：

电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。

CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题细胞生物学CellBio扫描电镜原理与应用：细胞生物学CellBio一、离心分离技术

用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物

差速离心：分离密度不同的细胞组分

密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离细胞生物学CellBio一、离心分离技术

用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合二、细胞内核酸、蛋白质、

酶、糖与脂类等的显示方法

原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。

FeulgenStaining细胞生物学CellBio二、细胞内核酸、蛋白质、

酶、糖与脂类等的显示方法三、特异蛋白抗原的定位与定性

免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限（图）

蛋白电泳(SDS)

与免疫印迹反应(Western-Blot)

免疫电镜技术：

免疫铁蛋白技术

免疫酶标技术

免疫胶体金技术

应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等细胞生物学CellBio三、特异蛋白抗原的定位与定性免疫荧光技术：细胞生物学Ce四、细胞内特异核酸的定位与定性

光镜水平的原位杂交技术

（同位素标记或荧光素标记的探针）

电镜水平的原位杂交技术

（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）

PCR技术

细胞生物学CellBio四、细胞内特异核酸的定位与定性 光镜水平的原位杂交技术五、放射自显影技术

原理及应用：

利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；

实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。

步骤：

前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）

———放射自显影细胞生物学CellBio五、放射自显影技术原理及应用：细胞生物学CellBio六．定量细胞化学分析技术

细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）

利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：

紫外光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法

流式细胞仪（FlowCytometry）

主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。

细胞生物学CellBio六．定量细胞化学分析技术细胞显微分光光度术（Micros一、细胞的培养

动物细胞培养

类型：原代培养细胞（primaryculturecell）

1-10代以内的细胞细胞生物学CellBio一、细胞的培养 动物细胞培养细胞生物学CellBio贴壁培养：培养细胞贴壁生长，呈多态性，单层生长，保持接触抑制，也叫单层细胞培养。细胞系：能够传代40-50次并且仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制行为的传代细胞。细胞株：经过生物学鉴定具有特殊遗传标记或性质的细胞克隆贴壁培养：培养细胞贴壁生长，呈多态性，单层生长，保持接触抑制连续细胞系：50代以后的，遗传物质发生改变、能够无限制的传代培养下去的细胞特点：染色体明显改变，一般呈亚二倍体或非整倍体连续细胞系：50代以后的，遗传物质发生改变、能够无限制的传代植物细胞培养

类型：原生质体培养（体细胞培养）

单倍体细胞培养（花药培养）

植物细胞培养类型：原生质体培养（体细胞培养）

二、细胞工程

细胞融合（cellfusion）与细胞杂交（cellhybridization）技术

单克隆抗体（monocloneantibody）技术

图

细胞拆合与显微操作技术

物理法结合显微操作技术(图1、图2)

化学法结合离心技术

制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。

其它技术

遗传分析（mutant,knockout,knockin）

细胞生物学CellBio二、细胞工程细胞融合（cellfusion）与细胞杂细胞拆合：把细胞核细胞质分离开来，然后把不同来源的胞质体和核体相互组合，形成核质杂交细胞。细胞操作技术：早起建立的一种实验胚胎学技术，即在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射的技术。细胞拆合：把细胞核细胞质分离开来，然后把不同来源的胞质体和核第四节细胞及生物大分子的动态变化一、荧光漂白恢复技术(FPR)用亲脂性或亲水性的荧光分子与蛋白或脂质偶联，用于检测所标记分子在活体细胞表面活细胞内部的运动及其迁移速率。原理：利用高能激光束照射细胞的某一特定区域，使该区域内的标记分子发生不可逆的淬灭，称为漂白区，随着脂质分子或蛋白质的运动，漂白去逐渐恢复到原有水平。第四节细胞及生物大分子的动态变化一、荧光漂白恢复技术(FPR第三章细胞生物学研究方法选编课件二、单分子技术与细胞生命活动的研究单分子技术：在细胞内实现观测单一分子运动规律的技术，可以在纳米空间尺度和毫秒时间尺度上精确测量单个分子的距离、位置、指向、分布、结构以及各种动态过程以工作原理分类：单分子光谱及成像、单分子操作及力学性质测量二、单分子技术与细胞生命活动的研究单分子技术：在细胞内实现观优点：实现直接观测单个分子的反应动力学的途径测量单一分子间相互作用力捕捉单一分子随机过程和分子构想变化的中间态测量稀发但重要的信号和分布测量非平衡态和不同步的体系优点：实现直接观测单个分子的反应动力学的途径三、酵母双杂交技术转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD），单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。三、酵母双杂交技术转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的第三章细胞生物学研究方法选编课件四、荧光共振能量转移技术原理：在一定波长的激发光照下，只有携带发光基团A的供体分子可以被激发出波长是A的荧光，而同一激发光不能激发携带发光基团B的受体分子发出波长是B的荧光，当吸收光谱A和吸收光谱B重叠，并且两个发光基团距离小到一定程度时会发生不同程度的能量转移，受体分子发出了波长是B的荧光四、荧光共振能量转移技术原理：在一定波长的激发光照下，只有携第三章细胞生物学研究方法选编课件五、放射自显影技术原理：利用放射性同位素的电离射线对乳胶的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究步骤：选合适的放射性前体分子做标记——按标记时间做标记——制片——曝光——再显影——定影——观察特点：可以对细胞内生物大分子进行动态研究和追踪五、放射自显影技术原理：利用放射性同位素的电离射线对乳胶的感第五节模式生物与功能基因组的研究一、细胞生物学研究常用的模式生物理想的研究材料是研究成功的关键在生物研究中通常采用：噬菌体、大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、四膜虫、黏菌海胆、拟南芥、斑马鱼和小鼠等特征：个体较小、容易培养、操作简单第五节模式生物与功能基因组的研究一、细胞生物学研究常用的模大肠杆菌原核生物的代表，一条环状DNA，大约编码4288个基因特点：培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱导、分离和鉴定容易酵母单细胞真核细胞的代表，有芽殖酵母，裂殖酵母大肠杆菌线虫成体长约1mm，由959个细胞组成线虫繁殖快，生长周期为3天，在显微镜下通体透明。胚胎发育过程中细胞分裂、分化及死亡具有高度的程序性线虫果蝇黑腹果蝇大约编码13600个基因作为遗传学的模式生物有100多年，与人类基因有很高的同源性果蝇二、突变体制备技术RNA干扰法包括瞬时干扰和永久干扰RNAi是利用一段特意的双链RNA或单链反义RNA通过注射、转染或转基因的方法导入到细胞或模式生物中，这样的RNA可以启动一套信号通路来最终降解与这段RNA对应的，通常是包含这段序列的mRNA，使该mRNA无法翻译成相关蛋白质。二、突变体制备技术RNA干扰法包括瞬时干扰和永久干扰第三章细胞生物学研究方法选编课件DNA敲除1.化学有变法：喂食有化学诱变剂的食物造成配子染色体突变特点：突变率高，但基因难定位2.P因子介导的突变：利用转座子带走部分DNA序列改变基因特点：突变率低，但针对性强3.基于同源重组的定点突变：基于同源重组技术特点：特异性高、受基因位置限制少、可在任意位点突变，但是相对耗时耗力DNA敲除三蛋白质组学技术蛋白质组学：全面研究细胞、组织乃至整个生命体内蛋白质组成及其活动规律的科学。双向凝胶电泳色谱技术质谱蛋白质芯片生物信息学三蛋白质组学技术蛋白质组学：全面研究细胞、组织乃至整个生命细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBioAcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-field;b)phase-contrast;c)DIC细胞生物学CellBioAcomparisonofyeastcellsth细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBioExamplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).细胞生物学CellBioExamplesofnegtivelystained细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物学CellBio细胞生物