高效液相色谱法测定饲料中磺胺类药物

高效液相色谱法测定饲料中磺胺类药物

磺胺类药物是指具有对氨基苯磺酰胺结构的药物的总称。这是一种用来预防和治疗细菌感染疾病的化疗药物。有几种应用，其中一些应用广泛，治疗效果好的药物。通过各种方法摄入的sas会将人体堆积，许多细菌会产生抗药性，这对人类的健康和生长发育有重大影响。许多国家规定将磺胺类药物作为预防和治疗药物使用。这种药物的使用方法可以是添加饲料、水提取物、丸状物或针剂。磺胺类药物是中国批准的抗凝剂。许多饲料加工将低剂量磺胺类药物添加到饲料中，以提高饲料转化率，防止疾病的发生。然而，一些养殖户会将磺胺类药物添加到动物饲料中，这对于提高了饲养者在动物源性食品中的保留。因此，在有效快速的饲料中检测磺胺类药物具有现实意义。AOAC有关饲料中磺胺类药物的检测方法为紫外分光法,另有报道采用HPLC法测定饲料中磺胺喹恶啉、磺胺二甲嘧啶及磺胺间甲氧嘧啶.本文采用缓冲液提取、HLB小柱净化,梯度洗脱-HPLC法同时测定饲料中十三种磺胺类药物,在30min内可以全部出峰,采用缓冲液提取避免了使用有机提取剂造成的污染,方法简便,适用性广,检测限低.1材料和方法1.1色谱柱及色谱柱Waters2695高效液相色谱仪,MeckPurospher®STARRP18色谱柱(150mm×4.6mm),涡旋振荡器、超声波清洗器、离心机、Supelco固相萃取装置.1.2标准溶液的配制(1)甲醇为色谱纯,盐酸为优级纯,磷酸二氢钾、磷酸氢二钾为分析纯.实验用水为去离子双蒸水,符合GB6682实验用水的规定.(2)固相萃取柱:OasisHLB型(60mg,3mL,美国Waters公司),使用前分别用3mL甲醇、0.1mol/L盐酸和水处理,保持柱体湿润.(3)磷酸盐缓冲液:称取8.0g磷酸二氢钾和2.0g磷酸氢二钾,定容到1000mL.此缓冲液的pH值为6.0.(4)磺胺类药物标准品:磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺二噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异恶唑、磺胺二甲异恶唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉标准品,购自Sigama公司.(5)十三种磺胺类药物标准溶液:准确称取适量的每种磺胺标准品,用乙腈配成100mg/L标准储备液,根据需要用流动相配成混合标准工作液.2实验部分2.1磷酸盐缓冲液的制备称取2g左右饲料样品于50mL离心管中,加20mL磷酸盐缓冲液,涡旋振荡2min后,40℃超声提取20min,4500r/min离心10min,取10mL上清液,加磷酸调节pH值为2.5左右.2.2高效液相的制备将上述溶液过HLB柱,调节流速约为2mL/min,待样液全部流出后,以10mL水淋洗,弃去全部流出液,再减压抽干10min,以5mL甲醇洗脱,洗脱液于35℃下氮气吹扫至干,以20%甲醇水溶液定容1mL,过0.45μm滤膜供高效液相分析.2.3条件1洗过仪和流动相测试3结果与讨论3.1样品预处理3.1.1有机溶剂的提取磺胺类药物是磺胺的衍生物,这类药物在N1位上存在着取代基,其分子结构式为:R为取代基,其中均有氨基.文献报道常采用甲醇、乙腈、二氯甲烷等有机溶剂提取组织中磺胺类药物残留,AOAC方法采用50%盐酸甲醇溶液提取磺胺二甲嘧啶.本文采用pH=6.0的缓冲溶液提取,试验发现,采用乙腈等有机溶剂提取,可以有效提取磺胺类药物,但由于净化用的固相萃取小柱为反相柱,故需先挥干有机溶剂,操作较为繁琐,采用缓冲液提取,提取液可直接上固相萃取小柱净化,避免了有机溶剂带来的污染,且回收率较稳定,效果理想.3.1.2s18固相萃取小柱的筛选一般来说,动物饲料均有不同程度添加各类维生素、矿物质等,也有可能添加一些兽药,给低含量水平的分析物检测造成困难,因此,适当的净化手段是必要的.采用C18小柱净化是最常见的净化手段,C18固相萃取小柱主要填充物带疏水基团,适用于非极性化合物的净化.近来文献常有报道采用OasisHLB小柱作为净化柱,HLB小柱的填充物二乙烯苯-N-乙烯基吡咯烷酮聚合物是亲脂疏水化合物.本文比较采用了SupelcoC18小柱(300mg/3mL)、OasisHLB小柱(60mg/3mL)进行实验,结果发现,两种小柱均能起到较好的净化作用,采用甲醇均可定量洗脱待测物.但实验同时也发现,在同样的条件下,不同批号的C18小柱重现性不够理想.本实验最后选用了OasisHLB固相萃取小柱,其柱效较高,60mg的填料即可有较好净化作用.3.2色度条件的选择3.2.1色谱柱的选择分别使用5μm的ZORBAXEclipse®XDB-C18(4.6mm×250mm)、Purospher®STARRP-18(4.6mm×250mm)、Purospher®STARRP-18(4.6mm×150mm)和SymmetrshieldTMRP18(3.9mm×250mm)4种色谱柱对十三种磺胺进行色谱行为的研究.结果发现,十三种磺胺在这四种色谱柱上均有较好的灵敏度,但要分离这十三种药物,须梯度洗脱,采用SymmetrshieldTMRP18柱,磺胺嘧啶出峰较早,梯度洗脱的条件难以设置.而采用250mm柱进行梯度洗脱,完全分离耗时长,磺胺喹恶啉需1h左右出峰,同时柱的平衡时间也长.本实验最终选用150mm的Purospher®STARRP-18柱为分析柱.3.2.2流动相的选择反相HPLC中常用缓冲液加一定比例的有机改性剂为流动相.本实验比较了0.01mol/mL磷酸二氢钾/乙腈、0.01mol/mL磷酸二氢钾/甲醇、0.3%乙酸/乙腈与0.3%乙酸/甲醇4种流动体系,发现在本色谱条件下,以乙腈作为有机改性剂的流动体系基线飘移明显,各谱峰分离情况不好.而无论是0.01mol/mL磷酸二氢钾/甲醇或是0.3%乙酸/甲醇的分离度与灵敏度均较好,同时保留时间较稳定,本实验采用0.3%乙酸/甲醇作为流动相.3.2.3空白饲料及标准溶液的配制13种磺胺类药物的最大吸收波长不同,大部分在265～270nm附近,磺胺喹恶啉为250nm左右,磺胺噻唑与磺胺二噻唑为285nm左右,本实验选择265nm为检测波长.按上述方法得到的空白饲料、加标饲料(添加浓度:1mg/kg)及十三种磺胺标准溶液(浓度为1mg/kg)色谱图见图1.3.3种药物的线性关系以13种标准溶液进样进行标准工作曲线的制作.以磺胺类药物的含量为横坐标、峰面积为纵坐标,得到线性方程,结果发现,13种药物在0.05～1.00mg/kg之间均有良好的线性关系,相关系数R均在0.9990以上.3.4回收率、精密度和回收率磺胺类药物与HLB小柱之间相互作用主要是疏水基团之间的相互作用,由于磺胺类药物的pK1为5.4～7.5,pK2为2.5左右,水溶性相对较好,而饲料中常因添加矿物质而使提取液呈碱性,因而本实验采用磷酸调节样液pH值为2.5左右后进行回收率实验,完全抽干水分后以甲醇为洗脱溶剂,磺胺类药物可被定量洗脱并能在高效液相上得到较好分离.用不含磺胺类药物的饲料样品进行三个添加水平的回收率和精密度实验,按本方法提取、净化,梯度洗脱/HPLC测定,结果见表1.由表1可见,对于饲料样品,13种磺胺在0.5mg/kg低水平的加标回