心房钠尿肽基因敲除小鼠的繁殖和鉴定

心房钠尿肽基因敲除小鼠的繁殖和鉴定

作为一种遗传因子药物，氨基钠尿（amp）是钠尿（np）家族的第一个成员。它主要由心脏的肌肉细胞合成和释放。钠尿醇受体（epr）可通过结合心脏、血管、胃肠道、中枢神经系统、淋巴组织、生殖器官和肾脏等组织或器官产生。促进细胞环磷酸酯（cdmp）的生成，并产生有助于钠胺和血管的利尿作用。最近研究发现,ANP具有抗肿瘤血管生成及促进肿瘤细胞凋亡的作用,但具体机制尚不清楚。由于基因工程小鼠具有能够从动物整体水平上模拟相关基因在体内的功能等诸多优势,因此本实验室在前期研究的基础上,从美国Jackson实验室引进了ANP基因敲除杂合子小鼠,并成功进行了繁殖和鉴定,为进一步研究ANP在肿瘤发生发展中的作用和相关分子机制提供理想的动物模型。1材料和方法1.1细胞培养ANP基因敲除小鼠由美国Jackson实验室引进(StockNumber:002685),品系背景为C57BL/6J,雌雄各2只,基因型为杂合子(ANP+/-)。1.2饲养及饲养管理小鼠饲养于SPF环境中,室内温度控制在22～26℃,湿度50%～65%,光照控制12h明/12h暗,小鼠笼盒、垫料、饮用水均经高温高压灭菌处理。饲料购自广东省医学实验动物中心。饲养过程中,每天进入动物房1次,观察小鼠生长情况,准时记录小鼠受孕分娩时间。垫料每周更换2次并补充食物和水。小鼠的繁殖采用将性成熟的小鼠(6～8周龄)以雌雄按1∶1的比例同笼合养。雌性小鼠的妊娠期为19～21d,哺乳期为18～21d,留种小鼠可延长至23d,哺乳期满的仔鼠要与母鼠分开,雌雄分笼饲养。配种小鼠定期给予灭菌葵花籽和蛋黄以补充营养。1.3子代的可能基因型由于引进ANP敲除小鼠为杂合子,根据孟德尔定律,其子代可能基因型为杂合子(ANP+/-)、纯合子(ANP-/-)及野生型(ANP+/+)。1.3.1小鼠细胞dna的提取剪取小鼠尾尖1～3mm,置于1.5mL离心管中,参照上海捷瑞生物工程有限公司细胞/组织DNA提取试剂盒说明提取小鼠DNA,加双蒸水于4℃保存。1.3.2ctgctgatg基因敲除菌基因引物1:CCTTCTATCGCCTTCTTGACG位于替换的基因片段用于检测突变型;引物2:CTGTCCAACACAGATCTGATG位于ANP基因敲除区域,用于检测野生型;引物3:CTGTTGCAGCCTAGTCCACT作为通用引物。反应条件为:94℃变性3min,94℃30s,61℃1min,72℃1min循环35次,72℃延伸2min。1.3.3引物扩增产物分析取PCR产物5μL于1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分析,引物1和引物3扩增产物大小为700bp,为纯合子小鼠;引物2和引物3扩增产物大小为434bp,为野生型小鼠;2条电泳条带均存在的为杂合子小鼠。2结果2.1生幼鼠的形态ANP基因敲除杂合子小鼠互交,成功获得子代小鼠。新生幼鼠呈肉红色,无毛,眼睑未张开,尾短,四肢不发达,活动能力有限;子代小鼠平均断乳期为20d,生长发育情况对比C57BL/6小鼠无明显异常。见图1。2.2小鼠电泳条带的生物量亲代ANP基因敲除小鼠均为杂合子配种,子代小鼠有杂合、纯合和野生型3种基因型。如图2所示,1、2、3、5、6号小鼠电泳条带位于700bp和434bp处为杂合子;7号小鼠电泳条带位于700bp处为纯合子;8号小鼠电泳条带位于434bp处为野生型。2.3小鼠基因型鉴定结果6个月共繁育小鼠7代/次,得到子代小鼠88只,其中雄性52只,雌性36只。经基因型鉴定,获得ANP+/+小鼠31只,ANP+/-小鼠49只,ANP-/-小鼠8只;纯合小鼠比例为9.09%,见表1。3anp基因敲除小鼠的临床研究ANP是1981年deBold等在心房肌细胞中发现的一类内分泌激素,最初命名为心钠素。后来经研究发现心钠素是由肽类物质构成的,因此最终将其命名为ANP。ANP针对心血管、呼吸系统等疾病的研究比较常见,但ANP在肿瘤生长中的作用报道较少。最近研究发现,ANP的受体NPRA在多种人类恶性肿瘤中高表达,如肺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤等,在一定程度上揭示了ANP对肿瘤的影响。有报道称,ANP基因编码合成的ANP前激素原(ANPprohormones,proANP),经蛋白酶加工形成4种心脏激素:长效型利钠肽(longactingnatriureticpeptide,LANP)、血管扩张因子(vesseldilator,VDL)、利钾尿肽(kaliureticpeptide,KP)以及ANP,这4种激素对多种肿瘤细胞有97%的抑制作用;在裸鼠实验中,其对人类胰腺癌、乳腺癌和小细胞肺癌的抑制作用分别达到了80%、66%和86%。但该抗肿瘤作用在自发型小鼠疾病模型中的研究还未见报道。ANP基因敲除小鼠是由北卡来罗纳大学的Dr.OliverSmithies于1995年构建的,主要用于研究心血管疾病和食源性高血压。该小鼠的主要表型为杂合子在低盐饮食情况下血压正常,高盐饮食表现为高血压;纯合子小鼠则无论在低盐或高盐饮食下都表现为血压异常升高。目前尚未见该品系小鼠在肿瘤研究中应用的报道。纯合子小鼠相对于杂合子小鼠能有更明显的表型,因此本研究希望通过繁殖获得大量ANP敲除纯合子小鼠,以便下一步研究工作的展开。由于引进的ANP基因敲除小鼠为杂合子,根据孟德尔遗传定律,子代小鼠可能出现3种基因型,即ANP+/+、ANP+/-和AN