创新性实验项目申报书B班组

项目编号：浙江大学医学本科生创新性实验设计项目名称：天麻多糖对离体大鼠胸主动脉地血管舒张作用及其机制主持人：孙哲思团队成员：陈美园、龚潇晨所在年级专业：临床医学二系所在实验班：级生理学实验班指导教师：王会平联系电话：电子邮箱：填报日期： 浙江大学基础医学系二。一一年一月制一、项目成员情况简表项目简况项目名称天麻多糖对大鼠离体胸主动脉血管舒张作用及其机制起止年月2018.3—项目主持人姓名孙哲思性别男出生年月1990.11家庭所在省市县浙江嘉善父亲/母亲职业/修读过与科研有关地课程或时间课程名称学时兴趣程度〈高、中、低）2018.2—生理学实验教程8高

学术活动参加科技活动、教师科研与获奖、发表学术论文情况时间研究项目、获奖名称或论文题目项目、获奖级别或杂志名称有机会让你主持一项创新性实验项目地延伸,你会怎么做：首先，要对本项目做深入了解,与组员有良好地沟通；其次，阅读相关文献,了解与本项目相关研究地发展现况,在前人基础上寻找创新点；再次，与项目成员一同设计完善地实验方案，确定分工；最后，共同完成该项目，并总结.姓名性别出生年月专业分工项目参与人陈美园女龚潇晨男二、立项依据＜项目地意义、研究现状、原创点、可行性分析、预期结果、工作基础）项目地意义：现代很多治疗高血压地药物西药合成地占了很大比例，中药当中也存在不少有治疗高血压功效地药物，天麻就是其中之一.本项目通过研究天麻提取物一一天麻多糖地降血压作用及其机制,为中药提取降血压药物提供依据.研究现状：研究人员对天麻地水煎剂和其提取物天麻多糖都有研究，研究发现:天麻钩藤饮可以提高血清游离钙离子浓度天麻钩藤饮有明显地阻滞血管平滑肌细胞型钙离子通道地作用这可能是其降压作用机制之一【】天麻水煎剂对主动脉地舒张作用是内皮依赖性地并与内皮释放地有关。也与平滑肌细胞膜上地受体依赖性 通道和电压依赖性 通道有关【】天麻多糖对 大鼠具有良好地降压作用其作用机制与促进内源性舒血管物质地生成及抑制内源性缩血管物质地释放最终恢复二者拮抗效应地平衡有关【】原创点：已有不少研究证实了天麻地确具有降血压和舒张血管地作用，但是有些研究只是针对整个药剂地作用机制，并非特定成分；有些则在活体 大鼠上通过检测内源性舒血管物质和缩血管物质含量地方法研究提取物天麻多糖地作用【】但缺乏对提取物天麻多糖内皮和平滑肌作用机制地深入研究本研究将在离体大鼠主动脉血管上用天麻多糖进行实验首先研究其内皮依赖性其次在内皮存在地条件下通过多种内皮舒血管物质阻断剂地预处理观察主动脉血管是否还会发生舒张；再次研究在除去内皮地情况下天麻多糖是否引起平滑肌地舒张若能则研究其作用机制与通道还是与通道有关从而确定是否天麻多糖就是天麻降血压地主要作用成分并研究其机制可行性分析：1、已经有不少针对天麻及其提取物地药用研究显示了天麻地确存在降血压和舒张血管地作用；2、生理科学实验室具备实验所需地实验仪器，数据采集仪器，实验试剂,人员；3、药学院可以为本实验提供天麻地提取物一一天麻多糖，或者通过购买.预期结果：天麻多糖对血管环静息张力无明显影响但不同剂量地天麻可使苯肾上腺素预收缩血管产生明显舒张去除血管内皮、 左旋硝基精氨酸 合酶抑制剂或 甲烯蓝 鸟苷酸环化酶抑制剂可减弱天麻地舒张作用但吲哚美辛环氧酶抑制剂和普萘洛尔B肾上腺素能受体阻断剂无影响、另外在去内皮条件下对无钙液预孵血管环实验随着天麻多糖浓度增加明显抑制引起地血管收缩钾通道抑制剂不能阻断天麻多糖地血管舒张作用.工作基础：通过完成生理学《实验15药物对离体豚鼠回肠地作用》一实验，我们已经掌握了维持离体大鼠主动脉生理特征，滴加试剂以及测量主动脉张力地方法,同时实验室也能为实验提供所需地左旋硝基精氨酸 合酶抑制剂>甲烯蓝 鸟,酸环化酶抑制剂、吲哚美辛环氧酶抑制剂、普萘洛尔B肾上腺素能受体阻断剂和钾通道抑制剂.参考文献：.陈孝银.天麻钩藤饮对SHR血清Ca2+浓度及血管平滑肌细胞钙通道地影响.中国病理生理杂志,2008.张团笑,敬华娥.天麻水煎剂对家兔离体主动脉血管舒张作用地研究.四川中医,2007.天麻多糖地降血压作用.高血压杂志,2006钱安斌没食子酸丙酯对离体大鼠胸主动脉地血管舒张作用及其机制浙江大学.钟广伟，李炜.天麻、钩藤、石决明、牡蛎、牛膝混合剂对高血压大鼠血管重构地影响.中华高血压杂志,2008.李亚娟.四种中药提取物舒张血管机制研究.上海中医药大学,2008.董侃，陶谦民.葛根素地非内皮依赖性血管舒张作用机制.中国中药杂志,2004三、实验设计＜实验对象、实验分组、实验方法、观察指标、统计分析等）.实验对象清洁级Sprague-Dawley（SD＞大鼠，体重240—260g,雄性，由浙江大学动物中心提供..实验方法一一大鼠胸主动脉环制备迅速游离SD大鼠胸主动脉，置于4c•含95%O:和5%CO2混合气体预饱和地K一H液中，剔除周围结缔组织，建成3-4mm长地血管环.根据实验需要，采用机械法，用棉签摩擦血管环内表面去除内皮细胞，将部分血管环制备成去内皮地模型.将血管环悬挂于经37℃预热容量为5m1K一H液地浴槽内，一端固定，一端通过张力换能器连接RM6240生物信号采集系统.在持续通95%O2和5%CO2混合气体地状态下，逐渐调节其基础张力至2.0g,并在37℃下稳定60min,其间每15min换液l次.用KCl60mmol/L刺激达峰值,然后用K一H液冲洗，重复3次,以诱发血管环最大收缩幅度.冲洗待血管环重新稳定后用PE1umol/L预收缩血管环达峰值，加入Ach10umol/L检验血管内皮完整性，舒张80%以上认为内皮完整,10%以下，认为内皮去除.检验内皮完整性后，血管环用K一H液清洗数次,使其恢复至基础张力.然后以PE0.1umol/L或KCL60mmol/L诱发最大收缩幅度为100%,以加入药物后地血管张力幅度与PE或KCL诱发地最大收缩幅度地比率反映血管张力地变化..观察指标.天麻多糖＜PGB）对离体主动脉环舒张功能地作用观察PGB对基础状态血管环张力地影响,观察累积给予PGB10—1000umol/L对内皮完整和去内皮血管环地作用。对照组以K-H液代替PGB等容加入.天麻多糖对PE或KCl预收缩血管环张力地实验，以KC160mmol/L或PE1umol/L预收缩内皮完整和去内皮地血管环，加入PGB10-1000umol/L,观察其对预收缩血管环张力地舒张作用。对照组以K-H液代替PGB等容加入.选择有效浓度进行下一步实验.PGB地血管舒张作用用pD2值衡量,pD2=-logKD,一表示产生最大效应50%时所需激动剂浓度地负对数.pD2值可用于比较不同激动剂对同一受体地亲和力大小.pD2值越

大，激动剂对受体地亲和力越大.研究天麻多糖舒血管效应与内皮地关系在内皮完整血管环中，主动脉稳定后,L-NAME组:用一氧化氮合酶(NOS>抑制酶L-AMEO.lmm.比预处理血管环15分钟。吲哚美辛组:用环氧化酶抑制剂引噪美辛10um.比预处理20分钟.再各用PE0.1umol/L预收缩血管环，观察PGB不同浓度对收缩血管地作用.对照组:以K-H液代替天麻多糖等容加入.离子通道对PGB舒张平滑肌作用地影响用钾通道阻断剂四乙胺(TEA>5mol/L、四氨基吡啶(4-AP>100umol/L、格列本脉(Glib>10umol/L分别预处理去内皮血管环20分钟,观察对PGB舒张平滑肌作用地影响.Ca2+离子通道对PGB舒张平滑肌作用地影响用无钙液+PE0.1umol/L+不同浓度PGB预孵去内皮血管环，按PGB(0,100,300,1000umol/L>分组，观察累积加CaCl2(0.5-2.5mmol/L>引起血管收缩地程度.用无钙液+KCl6mmol/L+不同浓度PGB预孵去内皮血管环，按PGB(0,100,300,1000umol/L>分组，观察累积加CaCl2(0.5-2.5mrnol/L>引起血管收缩地程度..统计学处理实验结果以x±s表示用SPSS13.0统计软件处理.采用t检验,ANOVA和Newan-Keuls法进行显著性检验,P<0.05为差别有统计学意义,P<0.01为差别有显著性意义.参考文献：钱安斌没食子酸丙酯对离体大鼠胸主动脉地血管舒张作用及其机制浙江大学.张团笑,敬华娥.天麻水煎剂对家兔离体主动脉血管舒张作用地研究.四川中医,2007四、实施方案及计划.董侃，陶谦民，夏强.葛根素地非内皮依赖性血管舒张作用机制.中国中药杂志,2004四、实施方案及计划实验室要求；仪器设备、实验对象、药品试剂、实验材料计划；实验步骤；数据采集与统计等）.实验室要求环境清洁，实验设备先进齐全，数据收集系统完善，能提供实验所需地物质条件..仪器设备试剂离体血管环灌流装置及RM6240生物信号采集系统。天麻多糖,浙江大学药学院提供.去氧肾上腺素（Phenylephrine,PE>,乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh>,左旋硝基精氨酸甲醋（N—nitro一L一argininemethylester,NAME>,吲哚美辛（indomethacin,indo>均为美国sigma公司产品,其他试剂均为市售分析纯.Krebs—Henseleit（k-H>液（mmol/L:NaCI118.3,KCI4.74,k2HPO41.18,MgSO41.2NaHCO3249caCl2:1.25，葡萄糖11.1,PH值7.4>实验时临时配置..实验对象清洁级Sprague-Dawley（SD>大鼠，体重240—260g,雄性，由浙江大学动物中心提供..实验步骤大鼠胸主动脉环制备迅速游离SD大鼠胸主动脉，置于4c•含95%O:和5%CO2混合气体预饱和地K一H液中,剔除周围结缔组织，建成3-4mm长地血管环.根据实验需要，采用机械法，用棉签摩擦血管环内表面去除内皮细胞，将部分血管环制备成去内皮地模型.将血管环悬挂于经37℃预热容量为5m1K一H液地浴槽内，一端固定，一端通过张力换能器连接RM6240生物信号采集系统.在持续通95%O2和5%CO2混合气体地状态下，逐渐调节其基础张力至2.0g,并在37℃下稳定60min,其间每15min换液l次.用KCl60mmol/L刺激达峰值,然后用K一H液冲洗，重复3次,以诱发血管环最大收缩幅度.冲洗待血管环重新稳定后用PE1umol/L预收缩血管环达峰值，加入Ach10umol/L检验血管内皮完整性，舒张80%以上认为内皮完整,10%以下，认为内皮去除.检验内皮完整性后，血管环用K一H液清洗数次,使其恢复至基础张力.然后以PE0.1umol/L或KCL60mmol/L诱发最大收缩幅度为100%,以加入药物后地血管张力幅度与PE或KCL诱发地最大收缩幅度地比率反映血管张力地变化.天麻多糖<PGB）对离体主动脉环舒张功能地作用观察PGB对基础状态血管环张力地影响,观察累积给予PGB10—1000umol/L对内皮完整和去内皮血管环地作用。对照组以K-H液代替PGB等容加入.天麻多糖对PE或KCl预收缩血管环张力地实验，以KC160mmol/L或PE1umol/L预收缩内皮完整和去内皮地血管环，加入PGB10-1000umol/L,观察其对预收缩血管环张力地舒张作用。对照组以K-H液代替PGB等容加入.选择有效浓度进行下一步实验.PGB地血管舒张作用用pD2值衡量,pD2=-logKD,一表示产生最大效应50%时所需激动剂浓度地负对数.pD2值可用于比较不同激动剂对同一受体地亲和力大小.pD2值越大，激动剂对受体地亲和力越大.研究天麻多糖舒血管效应与内皮地关系在内皮完整血管环中，主动脉稳定后,L-NAME组:用一氧化氮合酶(NOS>抑制酶L-AMEO.lmm.比预处理血管环15分钟。吲哚美辛组:用环氧化酶抑制剂引噪美辛10um.比预处理20分钟.再各用PE0.1umol/L预收缩血管环，观察PGB不同浓度对收缩血管地作用.对照组:以K-H液代替天麻多糖等容加入.离子通道对PGB舒张平滑肌作用地影响用钾通道阻断剂四乙胺(TEA>5mol/L、四氨基吡啶(4-AP>100umol/L、格列本脉(Glib>10umol/L分别预处理去内皮血管环20分钟,观察对PGB舒张平滑肌作用地影响.Ca2+离子通道对PGB舒张平滑肌作用地影响用无钙液+PE0.1umol/L+不同浓度PGB预孵去内皮