不同品种龙眼中多酚氧化酶活性研究

不同品种龙眼中多酚氧化酶活性研究

龙眼是著名的亚热带水果。中国是世界上最大、产量最高的龙眼种植区。长期以来,龙眼的加工产品仅限于桂圆肉、龙眼罐头、桂圆糖果等,这些产品的风味与龙眼鲜果相差甚远,营养损耗也大,已不能满足我国龙眼生产的发展和消费者的需求。而果汁的生产能较好的保持鲜果的色泽、风味及营养,是水果深加工的主要方向。但在龙眼汁加工过程中,褐变对龙眼果汁品质有着重要影响,特别是龙眼果肉酶促褐变较严重,并且发生迅速,因此对龙眼果肉中酶促褐变的相关酶类活性的测定及其性质的研究显得非常必要。多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)被认为是引起果蔬酶促褐变的主要酶类。目前,对龙眼果中PPO和POD的研究往往集中于对龙眼果皮的分析,而对龙眼果肉中PPO和POD的研究甚少,本实验着重对后者进行研究,拟为解决龙眼果汁生产中的酶促褐变问题提供理论基础。1材料和方法1.1供试品种、发酵工艺、低温超高速石硖广州土化果园;储良深圳南山果园;红核、沙梨木、水眼、双孖木、大乌圆、罗伞木、华路广眼、鸡卵眼摘自广东省农科院果树所;邻苯二酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、愈创木酚、乙醇、过氧化氢均为化学纯。低温超高速离心机Sigma3K30;高速分散均质机FJ-200。1.2实验方法1.2.1提取酶活性和浦o活力的测定1.2.1.磷酸盐缓冲液和高速离心液均质机破碎果实的活性多酚氧化酶和过氧化物酶的提取:取5g龙眼果肉,加入40mL0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)和0.5g不溶性PVPP,高速分散均质机低温下破碎果肉,用滤布过滤后,将滤液低温高速离心(4℃,12000×g)20min,取上清液作酶活测试。1.2.1.底物溶液的制备取1.8mL0.1mol/L邻苯二酚溶液和1mL磷酸盐缓冲液(pH6.4)于比色杯中,加入PPO粗酶液0.2mL混匀后,立即在410nm处比色并开始记录,空白为不加酶液的底物溶液。以每分钟引起吸光值改变0.001所需酶量为一个酶活力单位(U)。1.2.2不同品种龙眼纸浆中多酚氧化酶的活性测定分别从10个品种龙眼果肉中提取PPO,并对其活力进行测定。1.2.3邻苯二酚用量的确定分别取磷酸盐缓冲液(pH6.4)2.3、1.8、1.3、1mL于比色杯中,加入0.1mol/L邻苯二酚溶液0.5、1、1.5、1.8mL和PPO粗酶液0.2mL,混匀后,在410nm处比色,酶液加入后开始记录。1.2.4粗酶液添加量的确定分别取磷酸盐缓冲液(pH6.4)1.9、1.8、1.7、1.6、1.5mL于比色杯中,加入0.1mol/L邻苯二酚溶液1mL,再分别加入PPO粗酶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL,混匀后,在410nm处比色,酶液加入后开始记录。1.2.5多酚氧化酶的脱酶条件研究1.2.5.1ppo厚酶溶液注释条件研究将提取的粗酶液置于100℃水浴中,分别加热1、2、3、4、5min后,立即置于冰浴中,在常温下进行酶活测试。1.2.5.2龙眼纸浆中ppo的酶条件研究取石硖清洗、去皮、去核、打浆后,置于100℃水浴中分别加热1、2、3、4、5min后,立即置于冰浴中,在常温下进行PPO活力测试。1.2.6异常酶诱导剂1.2.6.粗酶液3.2在反应池中先加入1.5%(W/V)愈创木酚(溶剂为50%乙醇)0.5mL,0.5%(W/V)H2O20.2mL,0.05mol/LpH6.4磷酸盐缓冲液2.1mL,后加入前述1.2.1.1中提取的粗酶液0.2mL,在470nm处测定其吸光值的变化。以每分钟引起吸光值改变0.01所需酶量为一个酶活力单位(U)。1.2.6.pod活力测定将龙眼清洗、去皮、去核、打浆后,置于100℃水浴中分别加热1、2、3、4、5、6、7min后,立即置于冰浴中,在常温下进行POD活力测试。2结果与分析2.1储良的ppo多酚氧化酶活力从10种龙眼果肉中PPO活力测试结果(见图1)可看出:华路广眼的多酚氧化酶活力最强,而罗伞木最弱。广东主栽品种石硖和储良的PPO活力居中,其中石硖略低于储良。因石硖在所有品种中糖含量最高,并且其为主栽品种,而其PPO活力也较低,因此采用石硖制成龙眼汁最为合适。2.2实验结果的处理做出反应初速度V0随邻苯二酚浓度的变化曲线,如图2所示。可以看出,龙眼PPO所催化的酶促褐变反应的反应初速度随底物浓度的变化曲线类似于米氏方程所描述的反应初速度随底物浓度的变化规律,对实验结果进行相应的处理进行验证。米氏方程v=Vmax[s]Km+[s]v=Vmax[s]Κm+[s]可转化为1v=KmVmax×1[s]+1Vmax1v=ΚmVmax×1[s]+1Vmax形式。对实验结果进行处理,做出1/V0～1/[s]图,如图3所示。拟和直线相关系数达到0.9996,可见龙眼PPO的酶促褐变反应动力学符合米氏方程,根据直线斜率和截距可求得该反应的米氏常数Km=0.64mol/L,最大反应速度Vmax=0.12U/min,相应的动力学方程为v=0.12[s]0.64+[s](U/min)v=0.12[s]0.64+[s](U/min)。2.3酶浓度对酶活的影响由图4可以看出,在酶浓度较低时,随酶浓度增加,酶活力显著增加;当酶浓度达到一定值时,酶浓度与酶活的线性关系发生改变,原因是在酶浓度较低时,底物过量,随着酶浓度的增加,越来越多的酶分子与底物结合,此时,底物逐渐被饱和,直至达到最大饱和值。2.4龙眼果肉的ppo酶状况研究2.4.1浴加热dmin经研究发现,龙眼果肉PPO粗酶液经过100℃水浴加热1min即完全失活,并且加热3min后,酶液开始出现絮凝,这时PPO开始变性沉淀。从此实验可看出龙眼果肉中PPO粗酶液遇热较易失活。2.4.2完全失活的情况由图5可见,龙眼果浆在100℃高温下水浴加热5min时,可让多酚氧化酶完全失活。与粗酶液中多酚氧化酶失活时间相比,果浆需要更长的时间才能完全失活,这是因为果浆体积较大,需要更多热量,并且果肉中未溶出的PPO可能在加热的过程中溶出,因此要使果浆中的多酚氧化酶完全失活需要加热更长时间。2.5龙眼中氧化酶pod的形成条件研究2.5.1龙眼和麻黄之间的pod活性经测定,石硖龙眼果肉中POD活力为4440U/(g·min),可见龙眼中有着较高的POD活性,这也是龙眼和荔枝等亚热带水果在酶促褐变时易出现红色褐变的原因。2.5.2热处理对pod活性的影响从图6可以看出,POD在灭酶处理时间小于5min时,仍呈现较明显的活性;灭酶5min及6min后,在测试开始阶段未显出活性,但在等待2min后,其活性部分恢复;灭酶7min后,POD活性才完全丧失。这是因为POD的热失活都是一个双向和部分可逆的过程。所谓热失活的双向过程指的是POD中含有不同的耐热性质部分,其中不耐热部分在热处理时很快地失活,而耐热部分在同样温度下缓慢地失活;所谓热失活的部分可逆过程指的是经热处理后的酶液在室温或较低温度下保藏时,它的部分活力可以再生。由于POD酶这一特性,因此POD常被作为热处理条件的指标。从以上实验也可以看出,龙眼中POD的灭酶时间长于多酚氧化酶,所以POD应作为龙眼灭酶条件的指标。3多酚氧化酶活性的变化3.1在10个被测龙眼品种中,华路广眼的多酚氧化酶活力最强,为25440U/(g·min),而罗伞木最弱,为9120U/(g·min)。3.2龙眼PPO的酶促褐变反应动力学符合米氏方程,根据直线斜率和截距,可求得该反应的米氏常数Km=0.64mol/L,最大反应速度Vmax=0.12U/min,相应的动力学方程为v=0.12[s]/(0.64+[s])(U/min)。3