昆虫体内草鱼胺和酪胺的生物合成及调控

昆虫体内草鱼胺和酪胺的生物合成及调控

众所周知，肾上腺信号转导路径决定了人体生命活动中的许多生理活动。相应的神经变质（激素）、肾上腺和脱甲基肾上腺只存在于后口动物家族中。在原口动物包括昆虫体内,与肾上腺素和去甲肾上腺素系统对应的是章鱼胺(octopamine,OA)和酪胺(tyramine,TA),它们之间结构相似,并发挥着类似的生理作用(表1)。OA和TA作为神经递质(neurotransmitter)、神经调质(neuromodulator)以及神经激素(neurohormone),控制或调控着昆虫的很多行为和生理过程(Orchard,1982;Roeder,1999,2005;Hauseretal.,2006)。OA最早在章鱼唾腺中被发现至今已近60年(ErspamerandBoretti,1951),但至今我们对其在章鱼唾腺中的功能还不了解。更有趣的是,竟有4名诺贝尔奖获得者(AxelrodJ,GreengardP,HorvitzHR和KandelER)从事关于OA的研究。他们分别在章鱼胺受体(octopaminereceptors,OARs)识别、秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans体内章鱼胺功能以及脊椎动物体内痕量生物胺(traceamine)探寻等相关领域开展研究(NathansonandGreengard,1973;Saavedraetal.,1974;Evans,1981;Horvitzetal.,1982;Arakawaetal.,1990;Changetal.,2000)。潘灿平等(1999,2005)曾对昆虫体内OA的分布、生理功能以及作用机理和受体等研究进行了综述,并设计了多种OARs的激动剂,对它们的合成和构效关系等进行了研究(潘灿平等,1998)。OA作为昆虫体内重要的神经活性物质与昆虫的昼夜节律、内分泌、好斗与飞行以及学习与记忆等诸多重要生理功能有关(Roeder,1999),它主要通过与其特异性受体OAR结合从而调节胞内第二信使环腺苷酸(cAMP)或钙离子水平来发挥作用(NathansonandGreengard,1973;BlenauandBaumann,2001)。因此,对OA受体药理学特性的研究也因其可作为杀虫剂的潜在靶标而备受关注。TA作为神经递质,只是在近些年才被广泛关注。以前人们一直视其为OA的合成前体,而不把它作为独立的神经递质。而研究表明它不但像OA一样可作为神经递质、神经调质和神经激素,而且发挥着截然不同的作用(Nagayaetal.,2002;Lange,2009)。我国昆虫学家张宗炳教授及其研究小组很早就发现,在用DDT、溴氰菊酯以及杀虫脒处理昆虫后,利用三套层析系统检测技术,检测到中毒虫体内TA含量急剧增加,并且杀虫脒和DDT或溴氰菊酯合用时还有增效作用(张宗炳等,1984a,1984b;唐小丽等,1987);DDT处理同时还诱导相应的酪氨酸脱羧酶活性增加(罗远等,1985),而此酶的作用就是催化昆虫体内的酪氨酸生成酪胺。他们还发现杀虫脒类杀虫剂可引起虫体内cAMP含量的增加(马燕和张宗炳,1989),后来证明这类杀虫剂的作用靶标正是OA受体,而且很可能正是由于与OA受体偶联的相应G蛋白的激活引起了下游第二信使cAMP含量的增加。Borowsky等(2001)在老鼠等哺乳动物体内中检测到了TA,而其含量甚少故称之为痕量生物胺(traceamines);而在昆虫、甲壳纲和软体动物等无脊椎动物神经组织中则含有大量的TA(RobertsonandJuorio,1976)。Saudou等(1990)首先在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster中克隆到了酪胺受体(tyraminereceptor,TAR),而有趣的是,同样的受体基因同年也在《Neuron》杂志上被报道(Arakawaetal.,1990),但它却被命名为章鱼胺受体(OAR)。直到今日有关TAR和OAR的分类问题依然困扰着从事于此领域的生物学家和药理学家们。2009年在《Neuron》杂志上发表的TA参与秀丽隐杆线虫C.elegans逃生反应的实验也证明了TA不仅可作为神经调质还可作为神经递质与特定受体结合参与逃避等应急性反应(BranickyandSchafer,2009;Pirrietal.,2009),而调控这种反应的酪胺受体类型(tyramine-gatedchloridechannels)目前在昆虫中还未发现。尽管TA作为新的神经传递物质日益受到关注,但是对其受体以及受体药理学特性的研究还是相对较少。1两种脱羧酶法合成ta和高度自由基物体ta和其它基的植株和去甲肾上腺素pa的合成如前所述,昆虫体内的OA和TA与脊椎动物体内的肾上腺素和去甲肾上腺素功能颇为相似,在体内也都是以酪氨酸(Tyr)为底物通过一系列酶促反应合成的(图1)。酪氨酸可通过酪氨酸羟化酶(TH)羟基化作用生成多巴(DOPA),而酪氨酸与多巴又可分别在酪氨酸脱羧酶(TDC)和多巴脱羧酶(DDC)脱羧基作用下生成相应的TA和多巴胺(dopamine,DA),TA和多巴胺可进一步通过酪胺β-羟化酶(TβH)和多巴胺β-羟化酶(DβH)发生β-羟基化作用而生成相应的OA与去甲肾上腺素,从此可看出两条合成途径的相似性,去甲肾上腺素则可进一步在苯乙醇胺-N-甲基转移酶(PNMT)作用下生成肾上腺素(Cazzamalietal.,2005;Roeder,2005;Lange,2009)。另外,如果不存在酪氨酸脱羧酶(TDC),生物体内还有一些补救途径来完成TA和OA的合成(如图1中虚线箭头所示),目前还不知道这些补救途径有何生理作用(Roeder,2005)。2ta与aa神经元的分布在昆虫体内的许多生物胺都有着特有的分布特征,而OA和TA在昆虫体内的分布更是有趣。因为TA一直被视为OA的合成前体,其通过TβH作用生成OA(图1),所以OA的神经元也应该同时包含TA,因此,很有可能OA和TA被同一神经元所释放并作为协同的神经递质(co-transmitters)。另一方面,TA的神经元却不一定包含OA,Downer等(1993)就通过高效液相色谱与电化学检测(HPLC-ECD)相结合的方法,在蝗虫Locusta的中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)中发现,TA的分布并不与OA相对应。而且,在CNS的不同区域以及中枢神经和骨骼肌之间,TA和OA的分布比例也各不相同。在蝗虫的CNS中,OA的含量是TA的3～7倍,而在骨骼肌中TA的含量却是OA的2～9倍(DoniniandLange,2004;SilvaandLange,2008)。关于OA和TA在大型昆虫(如蝗虫)和小型昆虫(如果蝇)体内神经中的分布情况,Roeder等(2003)已经做了详尽的描述。在蝗虫中大约有100个神经元含有这些神经递质,它们的分布与其特异的重吸收系统(章鱼胺-转运体蛋白神经元)基本上是一致的;而在果蝇成虫的神经系统内大约有40种不同的神经元包含OA和TA,它们分布在果蝇的脑部、胸部和腹部的神经元中,奇怪的是在果蝇幼虫脑部却未发现具免疫活性的章鱼胺神经元(Roeder,2005)。Busch等(2009)通过免疫组织化学染色等手段,成功定位了果蝇成虫脑部27种独特的OA神经元,根据形态和遗传标记分布,他们发现这些OA神经元大都位于脑部的复杂结构中,有着明显隔开的树突和突触前区域,而且这些树突大都限定于大脑中的特定区域内,每个神经元的作用对象清晰而又各不相同,整个OA神经纤维网遍布于CNS内,使得它们能够相互结合并构成整体,并被分配到不同神经中行使各自功能。近年来,对TA在昆虫体内分布研究显示,昆虫脑部神经节、咽下神经节和胸腹部神经节中均有TA存在,尤其是在咽下神经节、胸部神经节以及腹部神经节这3个腹面不成对中间(ventralunpairedmedian,VUM)神经元中含量较多,这些VUM神经元连接着末梢肌肉组织对昆虫行为有着重要影响。更有意思的是,在蝗虫腹部第7和第8神经节中有大量对TA免疫的活性物质存在,而这些神经节与蝗虫的输卵管和受精囊活动有关(DoniniandLange,2004;LangeandSilva,2007;SilvaandLange,2008),而且TA还存在于昆虫非神经组织—马氏管中(Coleetal.,2005)。因此,TA很可能对昆虫的交配生殖和排泄行为都有所影响。总之,对OA和TA及其相应受体在昆虫体内分布的研究,可帮助我们更好地了解其生理学功能。3无脏器体内的转运体kraft在昆虫体内,一旦OA和TA从突触中释放,便结合于对应的受体引起一系列生理反应,那么它们在完成自己的作用后会发生什么变化呢?OA和TA在引起突触后细胞发生反应并产生相关信号后,它们的作用也就需要被终止,而最主要的方式就是被重吸收进入突触前结构中。对于很多神经递质,如OA、TA、多巴胺、5-羟色胺和组胺等生物胺来说,被神经细胞再摄取是它们主要的失活方式,而在通常情况下,这一步是通过特异的神经递质转运体(neurotransmittertransporters)来完成的。在被突触释放完成作用后,这些生物胺被存在于质膜上的转运体蛋白移除,转运体蛋白本身的活性的调节则主要依赖于胞内钠离子与氯离子的浓度梯度。相比而言,人们比较清楚脊椎动物中的转运体体系。在氨基酸组成上,它们是一些糖蛋白(glycoproteins),可能含有12个跨膜结构域(transmembranedomains),大约有50%～70%的序列相似性(Shafqatetal.,1993;Evans,2002;Malutanetal.,2002)。而在无脊椎动物体内,也已经识别出了对5-羟色胺、多巴胺、OA和TA特异的转运体(Malutanetal.,2002;DonlyandCaveney,2005),这些无脊椎动物体内的转运体与脊椎动物体内的转运体有着结构和药理特性上的相似性。Downer等(1993)首先报道了在蝗虫神经中枢中对TA有特异性重吸收现象的证据,而直到2002年,Malutan等(2002)才在粉纹夜蛾Trichoplusiani中克隆到了新的单胺转运体cDNA,并把它命名为OA转运体,在昆虫细胞系中表达显示其对章鱼胺和酪胺均有很高的亲和力(affinity)。这个转运体的独特性还在于它对药物的介入非常不敏感,如能够选择性抑制其他单胺转运体的三环类抗抑郁药(tricyclicantidepressants)等对其并没有阻断作用(Malutanetal.,2002;Gallantetal.,2003)。系统进化分析显示,这种鳞翅目幼虫的OA转运体属于一种新类型,它与无脊椎动物的DA转运体以及脊椎动物儿茶酚胺转运体(catecholaminetransporters)不属于同一类(Malutanetal.,2002)。OA转运体基因与TβH基因在神经元中是共表达的,所以它存在于所有含OA的神经元中。如前所述,这些神经元也包含TA,因此如果OA和TA都被释放的话,OA转运体很可能既协调对OA的摄取又参与对TA的再摄取。而奇怪的是,在黑腹果蝇D.melanogaster、冈比亚按蚊Anophelesgambiae、意大利蜜蜂Apismellifera和秀丽隐杆线虫C.elegans的基因组中均没有发现该类转运体,而且黑腹果蝇中的多巴胺转运体对OA几乎没有亲和性(DonlyandCaveney,2005)。另外,已经在6种鳞翅类昆虫如菜粉蝶Pierisrapae、欧洲玉米螟Ostrinianubilalis等及毛翅目、鞘翅目、直翅目、半翅目、广翅目和网翅目中克隆到了OA/TA的转运体基因,而在双翅目和膜翅目昆虫中却没有发现(Lange,2009)。以上研究证明,OA/TA的膜转运体广泛存在于很多昆虫种类的体内,并参与到这两种神经递质的再摄取机制中,造成OA和TA的失活或转移。既然OA和TA在果蝇中发挥着重要生理作用,而果蝇体内又不存在相应的转运体,所以很可能在双翅目和膜翅目中存在着其他的替代途径来完成OA和TA的转运。因此,有关OA和TA在昆虫体内,尤其是在双翅目和膜翅目昆虫体内的转运方式有待于进一步研究和探讨。另外,OA和TA以及类似的生物胺类如DA等,还可被一些单胺氧化酶(monoamineoxidase,MAO)类降解或被临近的神经胶质细胞(glialcells)吸收储存(Roder,2005)。4自组织的生长和生理作用对OA和TA在昆虫体内生理功能的研究一直没有中断过(表2)。目前,人们对OA的生理功能研究较为深入,最著名的就是它在北美萤火虫Photinuspyralis发光器官中所起到的神经传递作用(Nathanson,1979)。令人惊奇的是,在果蝇体内敲除了能够催化TA生成OA(图1)的TβH基因后,果蝇的行为几乎是正常的,只是雌性个体因不能正常产卵而不可育,该结果证明了OA可能参与调控输卵管的肌肉组织(Monastiriotietal.,1996;Monastirioti,2003)。在外周神经系统中(peripheralnervoussystem,PNS),OA起着调控昆虫飞翔肌、外周淋巴器官(如脂肪体和血淋巴)、输卵管以及几乎所有感觉器官的功能;而在CNS中,OA具有调控昆虫运动、觉醒、脱敏、学习与记忆以及昼夜节律等生理活动的功能(Stern,1999;Farooquietal.,2003;Schwaerzeletal.,2003)。而且,有关OA在昆虫的记忆力恢复、嗅觉识别、飞翔和好斗性等方面所扮演的角色也是近年来关于OA生理功能研究的热点(HammerandMenzel,1995,1998;Roeder,1999;Farooquietal.,2003;Schwaerzeletal.,2003;Mizunamietal.,2009)(表2)。相比于OA而言,人们对TA在昆虫体内的生理作用还不甚了解。然而近年来的研究表明,TA在生物体内发挥着自己特有的生理作用(Nagayaetal.,2002)。TA可以通过控制果蝇幼虫骨骼肌中的中央模式发生器(centralpatterngenerator)来控制果蝇幼虫的移动(Foxetal.,2006)。另外,它还存在于东亚飞蝗Locustamigratoria的受精囊和非神经元组织——马氏管中,并可能参与调控其排卵、受精、排泄和迁移等诸多生理行为(Blumenthal,2003;Rogersetal.,2004;Coleetal.,2005;LangeandSilva,2007;SilvaandLange,2008;Lange,2009),TA还影响着意大利蜜蜂A.mellifera雌蜂的卵巢发育等(SasakiandHarano,2007)(表2)。总之,昆虫体内的OA和TA几乎调控着昆虫大部分的器官和生理行为,而有关OA和TA对昆虫中枢淋巴器官(centrallymphoidorgan)和周围淋巴器官(peripherallymphoidorgan)的调控以及对昆虫神经、生殖、消化、内分泌乃至免疫和社会行为等诸多生理活动的影响,仍需要进一步研究与论述。5安氏原螯虾对g蛋白偶联受体的影响一种影响神经系统的化学物质,不管它是作为突触间隙的神经递质还是作为进入血液循环调控组织行为的神经激素,都需要通过细胞膜或者细胞内部的受体来完成其对细胞的影响,达到传递神经信号的目的。与肾上腺素和去甲肾上腺素相似,OA和TA也是通过与一系列的G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptors,GPCRs)相作用来完成神经信号传递,发挥其生理作用(Roeder,2005)。由于具有开发成为新一代杀虫剂靶标的可能性,近年来,关于它们对应受体的基因克隆及药理学特性的研究颇多。5.1结构分类及作用途径目前已经在多种昆虫中克隆到了编码OARs和TARs的cDNAs,包括黑腹果蝇D.melanogaster、意大利蜜蜂A.mellifera、美洲大蠊Periplanetaamericana以及一些蛾类,如烟草天蛾Manducasexta、烟芽夜蛾Heliothisvirescens和家蚕Bombyxmori等(Ebertetal.,1998;Blenauetal.,2000;Dacksetal.,2005;EvansandMaqueira,2005;Ohtanietal.,2006;Huangetal.,2009;Rotteetal.,2009),而这些受体通常有着双重术语——章鱼胺/酪胺受体(OA/TAreceptors)。尽管一些研究者通过体外表达实验证实了这些受体对OA和TA的不同亲和性,并据此将其命名为相应的受体(OAR或TAR),但其在昆虫活体内的确切配体(ligand)还不明了,仍需进一步研究验证。与之前在果蝇、蜜蜂、家蚕或者蝗虫中克隆到的TARs基因不同,Cazzamali等(2005)从果蝇中克隆到了一个新的TAR基因,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和爪蟾卵母细胞(Xenopusoocytes)中表达显示,它对TA的特异性非常高而与其他生物胺包括OA无交叉反应。而且在冈比亚按蚊A.gambiae、意大利蜜蜂A.melliefera和赤拟谷盗Triboliumcastaneum基因组数据库中也发现了与此受体类似的基因序列,并随之在家蚕中克隆到了该受体,被命名为BmTAR2(Hauseretal.,2008;Huangetal.,2009)。这些结果也再次证实了TA完全可以独立于OA而在昆虫体内通过特异性受体发挥作用。根据已经克隆到受体的功能和药理学性质及其与哺乳动物肾上腺受体不同亚型结构功能相似性的比较,可以将OARs和TARs各自分为两大类共4种受体类型:α1-adrenergic-likeOARs,α-adrenergic-likeOARs,α1-adrenergic-likeTARs和α2-adrenergic-likeTARs(EvansandMaqueira,2005;Huangetal.,2009,2010)。到目前为止,在果蝇和家蚕中的这4种OARs和TARs亚型都被克隆得到并做了功能验证,我们在二化螟Chilosuppressalis体内也克隆得到了这4种亚型,并进一步对其功能进行验证。有关昆虫体内OARs的研究较为广泛,关于其作用途径也相对了解较多。需要指出的是,有的受体可能同时扮演OARs和TARs的角色,这要看与之结合的神经激素或神经递质类型(HannanandHall,1996;Ohtaetal.,2003;EvansandMaqueira,2005)。5.2其他生物胺受体的偶联作用OARs和TARs被激活后会引起胞内信号分子浓度的改变,与受体作用的G蛋白(G-protein)类型不同引起的信号分子改变也不同,如:环腺苷酸(cAMP)和胞内钙离子(Ca2+)浓度,它们的浓度可能提高或降低(Gudermannetal.,1996,1997)。一种途径是当受体结合了能够与质膜上腺苷酸环化酶(adenylylcyclase,AC)作用的G蛋白时(图2),就能够激活此酶的活性,并导致ATP生成cAMP。而cAMP浓度的提高则能够进一步激活蛋白激酶A(proteinkinaseA,PKA),PKA又叫cAMP依赖性蛋白激酶,它能够将ATP的磷酸基团转移到特定蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上进行磷酸化,并调控多种分子底物的特性,包括细胞溶质蛋白、配体门控的离子通道以及一些转录因子如CREB,CREM和ATF-1等(DeCesareetal.,1999);另外,一些生物胺受体也有可能偶联抑制cAMP浓度提高的G蛋白。另一种途径则是激活的受体引起胞内Ca2+浓度的改变(图2),与这些受体偶联的G蛋白亚基能够结合并激活磷脂酶C(phospholipaseC,PLC)的活性(RheeandBae,1997),而此酶则能够水解一种膜结合底物——磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol4,5-bisphosphate),产生两种第二信使——三磷酸肌醇(inositoltriphosphate,IP3)和二酰基甘油(diacylglycerol,DAG),IP3能够结合于内质网膜上的特异受体,它们是一些门控Ca2+通道,能够使通道打开并引起胞内Ca2+库中的Ca2+释放到细胞质中,Ca2+通过直接控制酶或离子通道的活性在细胞许多功能中发挥着至关重要的作用。除此之外,Ca2+能够与很多蛋白结合,如钙调蛋白、钙结合蛋白、钙视网膜蛋白等,它们通过蛋白互作而起着调控许多蛋白效应器的活化。而DAG是存在于质膜上的第二信使,它能够与Ca2+一起激活蛋白激酶C(PKC)的活性,而PKC如前所述的PKA一样,都能够使很多蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化,从而改变这些蛋白的功能(BlenauandBaumann,2001)(图2)。总之,GPCRs的激活导致了胞内各级信号浓度的改变,而且不同胞内信号途径可能在同一个细胞中被激活,这也必将引起细胞内反应信号的放大或缩小从而达到信号传递的功能。另外,在果蝇中克隆到的命名为OAMB(octopaminereceptorinmushroombodies)的一种OAR,在神经和生殖系统的体外表达显示它具有两种异构体(isoforms),即OAMB-AS和OAMB-K3,并分别具有不同的信号转导通路,一个是只提高胞内Ca2+浓度,另一个则既提高胞内cAMP又提高Ca2+浓度,此Ca2+主要是连接钙调蛋白依赖型的蛋白激酶Ⅱ而并非激活PKA或PKC(Leeetal.,2009)。因此,同一个受体在不同组织或细胞类型中表达,可能会偶联不同的信号分子,从而行使不同的功能。有的受体仅仅依靠影响cAMP或Ca2+浓度来传递信号,而有的受体则既影响cAMP的浓度又影响胞内Ca2+浓度,这些特性给受体研究者们带来了惊喜,可给受体分类学者带来了困惑。而无疑的是,对OARs和TARs的研究不仅对理解它们在昆虫体内的生理学作用十分重要,也将为人们以其为靶标设计新杀虫剂用于害虫防治带来突破(IshaayaandHorowitz,2009)。5.3其他方面的研究对于昆虫体内OARs的药理学性质研究较为深入(EvansandMaqueira,2005),而关于TARs的药理学研究相对较少。有很多对OARs高度特异的激动剂(agonist)和拮抗剂(antagonist),而且已有针对OARs的杀虫剂在生产上使用,如杀虫脒(chlordimeform)和双甲脒(amitraz)就是通过各自代谢体与OARs特异结合来产生杀虫毒理作用的(Roeder,2005)。而由于一直没有把TARs作为杀虫剂作用靶标来开发,因此除了TA之外,还没有发现其他TARs的激动剂,唯一一个药理学上与TARs有关的复合物是对脊椎动物α2-肾上腺素受体(α2-adrenergicreceptors)有拮抗作用的育亨宾(yohimbine)——一种从育亨宾树上得到的生物碱,它对昆虫TARs同样有着高度特异的拮抗作用。由于缺少相关药理学实验工具,这对我们研究昆虫体内酪胺受体介导的神经传递带来了很大不便(Lange,2009)。目前,这些受体在细胞体外表达的药理学实验中,大多使用那些在脊椎动物体内对肾上腺素受体药理学性质比较清楚的化学剂,如OA、β-苯基乙胺(β-phenylethylamine)、色胺(t