基因工程疫苗研究进展

基因工程疫苗研究进展

2对小鼠的免疫作用随着对互补反应药物的研究的发展，可作为生物器的生物免疫药物的使用逐渐体现出其独特的优势和广泛的应用前景。国外在转基因植物中表达的已有细菌疫苗、病毒疫苗等,如大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位(LT-B)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、诺沃克病毒外壳蛋白(NVCP)、口蹄疫病毒(FMDV)、狂犬病病毒糖蛋白、变异链球菌表面蛋白(SPaA)、霍乱毒素B亚单位(CTB)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、兔出血病病毒(RHDV)、流感病毒血凝素和艾滋病病毒抗原等10多种疫苗,所涉及的宿主植物主要有马铃薯、烟草、莴苣、香蕉、番茄等(庞俊峰等,2011)。2.1大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位(LT-B)在诸多研究中,对LT-B转基因植物的研究相对较多,效果也较好。1995年Haq等用LT-B编码基因导入烟草和马铃薯中,外源基因均能表达,并有较好的免疫原性。利用烟草叶浸提物直接饲喂小鼠,免疫30~32d后,血清IgG和黏膜IgA抗体水平与同剂量细菌性LT-B灌服的免疫小鼠抗体水平完全一致。Karaman等(2006)将大肠杆菌热敏肠毒素基因转入玉米中,通过对基因的改造,使其表达一种无毒性的LT-B蛋白;用这种转基因玉米饲喂幼年和成年小鼠后,小鼠体内均产生了免疫反应。Lauterslager(2001)等利用农杆菌Ag10转化马铃薯,约有一半转基因植株中的LT-B表达量都较高。又有研究结果表明,人生食转LT-B基因马铃薯,7d后,在血液和粪便中可部分检测出IgA和IgG特异性抗体,并证明有中和活性,但不同个体食用转基因LT-B疫苗后反应均有不同。2.2乙型肝炎病毒表面抗原乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的以肝脏为主要损害器官的传染病,也是世界上最常见的传染病之一。近年来,编码乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的基因成功导入了大豆悬浮细胞、羽扇豆、马铃薯及烟草等植物中(Lou等,2007)。第1次关于乙型肝炎病毒表面抗原的研究是Mason等在1992年采用农杆菌LBA4404介导的方法在烟草中表达乙肝表面抗原HBsAg。Koprouski等(1995)通过农杆菌介导法用rHBsAg基因转化羽扇豆和莴苣,用获得的转基因植株饲喂小鼠,结果检测到显著的乙肝病毒特异抗体;人食用转基因莴苣,也获得了IgG抗体应答。赵秀英等(2002)利用基因枪转化胡萝卜悬浮培养细胞,提取10株NJH-T5分化幼苗的蛋白质经酶联免疫反应(ELISA)检测,其rHBsAg、preS2Ag均为阳性。为方便口服,人们逐渐尝试利用普通水果、蔬菜等植物来表达抗原蛋白。娄晓鸣等(2005)将乙肝表面抗原蛋白基因在苹果和番茄中转化表达,ELLSA检测其蛋白在苹果核和番茄中被正确表达,通过电镜对苹果叶片及番茄果实提取物进行观察,结果发现了HBsAg颗粒。2003年中国研究者成功地将HBsAg基因导入樱桃中,并用樱桃浆果组织饲喂小鼠,小鼠成功产生免疫抗原性,并与经商业疫苗免疫的小鼠具有相似性(Gao等,2003)。但HBsAg在莴苣叶片、香蕉果肉中的表达量很低,目前还在初级试验阶段,在可食用转基因植物中表达量最高的是在马铃薯中。2.3口蹄疫病毒口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种感染偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病(吴国华等,2008)。口蹄疫结构蛋白VP1为主要抗原位点,能诱导机体产生抗FMDV中和抗体和抗病毒保护性免疫,是基因工程疫苗研究的主要对象。用此VP1蛋白基因转化芥菜和苜蓿(Carrillo等,1998)可成功获得转基因植株,用含有重组口蹄疫VP1的叶片浸提物直接饲喂免疫小鼠,均可诱导产生特异性抗体,这种抗体不仅能与VP1发生反应,而且也能与完整的口蹄疫病毒颗粒发生反应(Wigdorovitz等,1999),所有的免疫小鼠都能抵抗口蹄疫病毒的攻击。Dus等(2002)将口蹄疫VP1蛋白与GUS融合基因在转基因苜蓿中表达,表达量为可溶性蛋白总量的0.5%~1.0%,供试小鼠产生了相似的病毒特异性免疫反应。宋东光等(2011)利用国内自主克隆的马铃薯块茎专一性表达classⅠpatatin的启动子与VP1基因融合,通过农杆菌介导获得转VP1的马铃薯植株,进一步检测其表达及免疫原性,为开发FMDV口服疫苗打下了基础。2.4诺沃克病毒外壳蛋白(NVCP)诺沃克病毒是一种能够引起人类剧烈胃肠炎的病毒。Mason等(1996)在研究转基因植物表达rHBsAg、rLT-B的基础上,利用农杆菌LBA4404转化马铃薯和烟草,在其中表达的rNVCP具有良好的免疫原性。用转化后的烟草叶片与马铃薯块茎分别饲喂小鼠,均能产生特异性抗体。Tacket等(2000)报道,20个志愿者食用转基因马铃薯后,有19人产生了特异性免疫应答,抗NVCP的IgG滴度比免疫前上升了12倍,IgM上升了7倍。2.5狂犬病病毒糖蛋白狂犬病是一种由狂犬病毒引起的急性中枢神经系统传染病,主要是通过感染动物的唾液进行传播。McGarvey等(1995)和Sun等(2003)都将狂犬病病毒G蛋白基因转入过番茄,获得的转基因番茄植株中表达的重组蛋白能与多克隆抗体形成免疫沉淀,表达产物均能诱导机体产生特异性抗体,但G蛋白的表达量很低,每克可溶性蛋白中只含1~10ngG蛋白。番茄表达的糖蛋白已具有天然糖蛋白的主要抗原决定簇,能与天然糖蛋白诱导的多克隆抗体发生免疫反应。用含有狂犬病病毒的重组植物病毒免疫小鼠,小鼠产生了中和性抗体,用被重组病毒感染的菠菜叶饲喂小鼠,均能产生免疫应答,40%的小鼠能够抵抗高剂量狂犬病病毒的攻击(Modehka等,1998)。3基因疫苗的免疫抑制效果3.1免疫原性和免疫保护效果问题转基因植物疫苗能否产生免疫原性,是研究植物基因工程疫苗的根本。植物基因工程疫苗的研究虽已取得较大进展,但仍存在诸多问题,如免疫原性低,抗原在消化道内易被不同程度降解,从而影响免疫保护率等问题。有2个因素要予以考虑和研究:①基因工程疫苗的分子质量很小,作为抗原其免疫原性会减弱;②植物本身可能含有一些因素会影响或干扰重组蛋白产生免疫原性,这需要进一步的研究证明。要提高免疫原性,防止抗原在口服时被消化降解,可在抗原基因附近加上一些修饰基因或吸附基因序列(曲静等,2010),或将抗原组装成病毒颗粒样的有序结构,以增强其免疫原性,保护口服疫苗不被迅速消化,长时间停留在消化系统内。Modelsk等(2003)试验证明机体食用植物组织比食用植物组织提取物产生的保护性免疫反应更强,这是因为抗原在植物中被坚实的细胞壁或膜腔包裹,在胃中不易被胃液消化降解,大大提高了转基因植物抗原的免疫原性。一些志愿者口服转乙型肝炎表面抗原基因的马铃薯,绝大部分志愿者血液中的抗乙型肝炎表面抗原的抗体明显增强,且没有产生任何不良的副作用(Thanavala等,2005)。这2个试验说明在消化道中植物细胞壁对抗原确实具有保护作用,在经过消化道的过程中,使植物细胞内的疫苗免受酸性环境的影响和各种消化酶类的降解。经研究结果发现,传统疫苗与基因工程疫苗联合使用时可加强免疫效果。Webster等(2002)通过试验证明,小鼠经单剂量的麻疹病毒血凝素DNA疫苗免疫后,再口服血凝素植物转基因疫苗提取物,特异性IgG滴度可以提高10倍。Wu等(2004)研究也发现,鸡传染性法氏囊病在传统疫苗免疫下,只能使鸡产生78%的保护力,而在传统疫苗免疫1周后口服转基因植物疫苗,可使鸡产生90%的保护力。Richter等(2001)研究结果表明,用商业来源的乙肝疫苗对小鼠进行初免疫后,再用转基因马铃薯表达的乙肝疫苗再次免疫,结果显示免疫应答得到高度加强。Thanavala等(2005)对注射过乙肝亚单位疫苗的志愿者的HBsAg免疫原性进行观察,然后生食2次和3次转基因马铃薯(每次100g),再次观察表达的HBsAg免疫原性,分别有52.9%和62.5%的志愿者血清抗体有33倍和56倍的增长。由此可见,基因工程疫苗为提高其他类型疫苗的保护效果提供了一种新的途径。3.2外源蛋白在植物中的表达量问题转基因植物疫苗抗原表达量低也是限制其发展的主要因素之一,其表达水平很大程度上取决于表达的蛋白质和用于表达植物的种类,构建的表达系统也影响抗原的表达水平。虽然抗体的表达量可以达到总可溶性蛋白的8%,但是其他蛋白质的表达水平几乎没有超过0.40%的(Ma等,2005)。目前已研究出提高抗原表达量的方法有许多种,包括定位表达、通过融合蛋白表达抗原蛋白、加上强启动子、优化外源基因密码子、多种疫苗联用等。随着植物基因工程疫苗研究的深入,体细胞胚悬浮培养系统和毛状根培养系统可能会成为提高抗原蛋白基因在植物体内表达的另一种方法。3.3生物安全问题转基因植物疫苗的安全性问题包括环境安全性问题和食用安全性问题。环境安全性问题主要表现在转基因植物可以通过花粉传播造成基因漂移,影响环境生态平衡,对环境中许多有益生物产生直接或间接的不利影响。此外,转基因植物还可能将一些抗病或对环境胁迫具有耐性的基因转移给杂草,严重威胁其他作物的正常生长和生存(朱峰伟等,2010)。另外,由于绝大部分转基因植物的筛选都是通过抗生素基因进行的,长期使用使微生物产生抗性,不仅会造成环境安全性问题,还可能造成食用安全性问题。目前,有学者提出要改进转化技术,避免使用含抗生素抗性基因的载体,由此减轻进而消除此方面的危害(程志强等,2002)。人或动物口服转基因植物后还可能对机体产生某些毒理作用或引起过敏反应,这些不良反应在进行临床试验前必须进行充分的试验论证,确保使用转基因植物疫苗的安全性(Carter等,2002)。除安全问题以外,现有研究还存在一些其他困难。如人类对各类植物的基因构成不够了解,转基因植物仅限于模式植物(如烟草、马铃薯等),这些植物由于各种原因不能直接食用,必须对其表达的疫苗进行分离纯化,从中提取抗原,后期费用较大,这样基因工程疫苗就失去了与传统疫苗生产系统相比在价格上的优势(王军政等,2011)。因此,要不断开发蔬菜、水果等可直接食用的宿主植物。现阶段的研究水平较低,使在目标宿主植物的选择上受到局限,而如何调控水果内疫苗物质的生成量,如何标注有效剂量,可食部位抗原的稳定性,以及服用时间的差异问题也需深入研究。由于转基因沉默或外源基因丢失等原因,常使外源基因在植物中表达不稳定,转基因植物疫苗所需的使用剂量就很难确定,限制了植物基因工程疫苗的商业化生产(朱宏等,2009)。虽然,能稳定表达外源基因的转基因植物可以通过筛选后代得到,但是筛选过程复杂、耗时。因此,研究出更为有效的方法来解决转基因植物中外源基因表达不稳定性的问题是下一个研究重点。除此之外,口服免疫产生的免疫耐受、免疫记忆等需进一步研究。免疫耐受的程度与免疫剂量﹑免疫程序﹑抗原特异性等多种因素有关。研究结果证明,减少疫苗服用次数,加大每次摄入量等方法可以减少免疫耐受的发生。Antzen等认为,饲用植物疫苗抗原只要是模仿病原因子(病毒样颗粒或毒素等),就不会引起免疫耐受,但同时也承认,对此还要仔细研究(任雪艳等,2004)。4转基因植物疫苗目前,植物基因工程疫苗的研制尚处于初级阶段,还未培育出成熟的植物转基因疫苗品种,但相关研究已取得较大进展。植物系统生产的抗原疫苗可保持天然免疫原的形式,使大规模生产抗原疫苗成为可能,利用植物基因工程疫苗技术生产畜禽疫苗也更具有现实意义和发展潜力。植物可食疫苗既可以提高其他类型疫苗的免疫效果,同时也可以避免其他类型免疫多次接种的繁琐操作,应用前景广阔,因此对可食疫苗机理的研究,如确定食用疫苗的安全性、有效剂量及抗原含量的稳定性是重要的研究课题。研制疫苗的根本目的就是要获得巨大的经济效益和社会效益,将不同抗原基因的转基因植物进行杂交,容易获得多价转基因植物疫苗,能降低生产成本、简化免疫程序,且可以克服不同病毒弱毒苗间产生的干扰现象,因此这将是基因工程疫苗研究的主要方向。该领域的研究将促进相关机制的认识,从而推动整个疫苗研制的发展。转基因植物可食疫苗利用分子生物学技术,将病原微生物的抗原编码基因导入植物,并在植物中表达出活性蛋白,人或动物食用含有该种抗原的转基因植物,会激发肠道免疫系统,从而产生对病毒、寄生虫等病原菌的免疫能力(Mason等,2002)。它没有病原菌完整的侵染能力,却可以使机体对特异病毒或细菌产生免疫应答反应,简单来说,转基因植物疫苗是利用植物系统表达病原菌抗原蛋白1个或几个亚单位的疫苗。Tacket等(1998)首次报道了在烟草中表达链球菌(Streptococcus)抗原蛋白SpaA,Mason等在1992年提出了利用转基因植物生产疫苗,1997年,转基因可食植物疫苗的第1次临床试验证明了植物基因工程疫苗在抵抗传染病方面的巨大潜能。利用植物作为抗原表达和递送的载体已经成为当今生物技术研究的热点之一,转基因植物可食疫苗的应用前景广阔,受到国内外学者的广泛关注。1真核实验疫苗传统疫苗在预防疾病的传播过程中发挥了重要作用,但也存在着许多不尽人意的地方,如生产成本较高、接种方式复杂及潜在安全性等问题。现今,疫苗的类型由菌体疫苗发展到亚单位疫苗、DNA疫苗等,但这些疫苗价格昂贵,不易大面积推广使用。转基因植物疫苗的载体为高等绿色植物,是一种较为完善的真核表达系统,与生产传统亚单位疫苗的大肠杆菌和酵母大有不同。这种疫苗以植物作为生物反应器(庞俊峰等,2011),环境的适应能力更强,培养的条件更为宽松,前期不需要专用的设备和培养基,后期