渔用枯草芽孢杆菌微生态制剂培养基配方优化试验

渔用枯草芽孢杆菌微生态制剂培养基配方优化试验

随着水产养殖的发展和水产养殖规模的提高，水产养殖环境恶化，水生动物病虫害频繁发生。1材料表面1.1病毒枯草芽孢杆菌,威海海洋职业学院海洋生物与医药系微生物实验室自南美白对虾养殖池底分离保藏。1.2培养基的制备种子培养基(LB培养基):胰蛋白胨10g,氯化钠10g,酵母浸出粉5g,pH值为7.2;碳源基础培养基:酵母粉0.1%,氯化钠1%,pH值为7.0;氮源基础培养基:葡萄糖5%,氯化钠1%,pH值为7.0;无机盐基础培养基:葡萄糖5%,酵母粉0.1%,pH值为7.0;种子培养基121℃、0.11MPa灭菌20min,其余含糖培养基115℃、0.07MPa灭菌15min。1.3试剂及仪器蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、硫酸铵、硫酸铜,国药集团化学试剂有限公司生产;硫酸镁、氯化锰,天津市光复科技发展有限公司生产;硝酸钠、亚硝酸钠,天津市大茂化学试剂厂生产;磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化铁、氯化钠,天津科密欧化学试剂有限公司生产;蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉,北京奥博星生物技术有限公司生产;绵白糖,营口北方糖业有限公司生产;鱼粉,山东省荣成市海产品有限公司鱼粉厂生产。1.4实验仪器和仪器电子天平(型号为BS2202S),购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;磁力搅拌器(型号为HJ-4),购自金坛市天竟实验仪器厂;恒温培养振荡器(型号为ZWY-211B),购自上海智城分析仪器制造有限公司;高压蒸气灭菌锅(型号为XFH-50CA),购自浙江新丰医疗器械有限公司;可见分光光度计(型号为V-1200),购自翱艺仪器(上海)有限公司。2方法2.1培养、活化菌种取一环冻存菌液划线接种于LB固体培养基中,37℃恒温培养20h,活化菌种。然后用接种环蘸取菌落较大的活化菌种于盛有100mL种子培养基的250mL三角烧瓶中180r/min、37℃培养20h。2.2无机盐基础培养基碳源基础培养基中分别添加5%蔗糖、绵白糖、麦芽糖、葡萄糖、红糖、可溶性淀粉;氮源基础培养基中分别添加0.5%蛋白胨、牛肉浸粉、花生饼粉、酵母浸粉、鱼粉、黄豆粉、尿素、硫酸铵、硝酸钠、亚硝酸钠;无机盐基础培养基中分别添加1%氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁、氯化锰、硫酸铜、氯化铁。接种2%的含菌种子培养基于灭菌的装液量为200mL的500mL三角烧瓶中,37℃、180r/min培养36h,每个培养基做3个平行,根据生物量优化碳源、氮源、无机盐种类。2.3最优金属培养基的添加量设计在上述试验结果的基础上,碳源基础培养基分别添加1%、3%、5%、7%、9%、11%的最优碳源;氮源基础培养基分别添加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%的最优氮源,无机盐基础培养基分别添加0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.30%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.20%、1.40%的最优无机盐。接种2%的种子培养基于灭菌的装液量为200mL的500mL三角烧瓶中,37℃、180r/min培养36h,每个条件做3个平行,依据生物量优化碳源、氮源、无机盐的添加量。根据单因素试验的碳源、氮源、无机盐添加量的结果,设计正交试验L2.4最优初始ph值的确定以不同的初始pH值(4,5,6,7,8,9,10),按照优化好的培养基配方,接种2%的种子培养基于灭菌的装液量为200mL的500mL三角烧瓶中,37℃、180r/min培养36h,每个条件做3个平行,依据生物量判断最优初始pH值。在最优的初始pH值下,考察不同接种量(2%、4%、6%、8%、10%、12%)对生物量的影响;在最优的pH值和接种量下,考察不同的培养温度(28,31℃,34,37,40℃)对生物量的影响;在最优的pH值、接种量和培养温度下,考察不同的转速(120,140,160,180,200,220r/min)对生物量的影响;在最优的pH值、接种量、培养温度和转速下,考察不同培养时间(0,2,4,6,8,10,12,……50h)对生物量的影响。2.5生物量测量以未接种的培养基作空白对照,测定OD2.6数据统计分析采用GraphPadPrism5软件整理试验数据及作图,采用IBMSPSSStatistics22.0软件进行方差分析,采用F检验对正交试验结果进行差异显著性分析,数据以“平均值±标准误”表示,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。3结果与分析3.1培养基制备的组成的优化3.1.1蔗糖和麦芽糖对枯草芽孢杆菌生长的影响由图1可知,影响枯草芽孢杆菌生长的碳源依次为绵白糖>蔗糖、麦芽糖>葡萄糖>红糖>可溶性淀粉。蔗糖和麦芽糖对枯草芽孢杆菌生长的影响大于红糖,这可能是由于红糖中杂质较多,某些成分抑制了菌体的生长。另外,单糖(葡萄糖)和二糖(蔗糖、麦芽糖)对枯草芽孢杆菌生长的影响大于多糖(可溶性淀粉)。因此,选择绵白糖作为最优碳源。3.1.2氮源对枯草芽菌的生长影响由图2可知,对枯草芽孢杆菌生长影响最大的氮源为鱼粉,其次是酵母浸粉和黄豆粉,有机氮OD3.1.3无机盐对枯草芽菌的生长的影响由图3可知,对枯草芽孢杆菌生长影响最大的无机盐种类为磷酸氢二钾,OD3.2干预培养基成分的含量3.2.1添加碳源对枯草芽菌的生长影响由图4可知,随着绵白糖添加量的增加,枯草芽孢杆菌的生物量先升高后降低,当添加量为7%时枯草芽孢杆菌的生物量OD3.2.2氮粉添加量对枯草芽孢杆菌生长的影响由图5可知,鱼粉添加量≤3%时,枯草芽孢杆菌生物量增幅缓慢,当鱼粉添加量为4%时,生物量较3%时明显增长,当鱼粉添加量在5%~9%时,枯草芽孢杆菌生物量增幅较慢,鱼粉添加量≥10%时,生物量开始下降,这可能是由于鱼粉中的某些物质累积量过高时抑制了枯草芽孢杆菌的生长。因此,从经济的角度出发,选择4%的鱼粉添加量为宜。3.2.3枯草芽孢杆菌添加量单因素试验结果由图6可知,当磷酸氢二钾添加量为0.10%时,枯草芽孢杆菌生物量增幅最大,此后随着添加量的增加,枯草芽孢杆菌的生物量先小幅增加后趋于平稳,当添加量超过1.00%时,枯草芽孢杆菌生物量开始急剧下降。综合考虑,选择0.15%的磷酸氢二钾为适宜添加量。3.2.4枯草芽孢杆菌最佳配方优化试验设计在单因素试验的基础上,设计正交试验(见表1),研究绵白糖(A)、鱼粉(B)和磷酸氢二钾(C)3因素最优组合水平,得出适合枯草芽孢杆菌生长的最优配方组合。正交试验设计及结果分析见表1,方差分析见表2。由表1可知,通过极差分析,R由表2可知,通过方差分析,鱼粉、绵白糖的P值均<0.01,对枯草芽孢杆菌生长量影响极显著,而磷酸氢二钾的P值>0.05,对枯草芽孢杆菌生长量影响不显著。3.3培训条件的优化3.3.1ph值的初始优化由图7可知,在初始pH值为7时,枯草芽孢杆菌的生物量最大,OD3.3.2接种量对枯草芽孢杆菌生长的影响由图8可知,随着接种量的增加,枯草芽孢杆菌的生物量随之升高,当接种量≥6%时,枯草芽孢杆菌的生物量趋于平稳,因此选择6%为最适接种量。3.3.3温度优化由图9可知,随着培养温度的升高,枯草芽孢杆菌的生物量随之升高,当温度为37℃时,生物量达最高值,OD3.3.4优化速度由图10可知,随着转速的增加,枯草芽孢杆菌的生物量逐渐升高,当转速为200r/min时,生物量最高,OD3.3.5枯草芽孢杆菌生长期及数量测定由图11可知:在0~8h,枯草芽孢杆菌生物量增加缓慢,处于延迟期;在8~32h,枯草芽孢杆菌生物量急剧增加,处于对数期;在32~40h,生物量趋于平稳,处于稳定期,在此期间可获得较高的菌体数量;当培养时间大于40h后,菌体处于衰亡期。因此,选择最佳的培养时间为32h,此时OD4讨论和结论4.1碳源种类对枯草芽孢杆菌生长的影响微生物在新陈代谢过程中,必须吸收充足的水分以及构成细胞物质的碳源、氮源以及钙、镁、钾、铁等多种矿物质元素和一些必需的生长辅助因子才能正常生长繁殖。因此,在枯草芽孢杆菌的生长配方优化中,选择3个主要的因素———碳源、氮源和无机盐作为考察对象。在碳源的考察中,选择葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和以蔗糖为主要成分同时还有少量杂质的绵白糖,含有维生素和微量元素的红糖及可溶性淀粉,结果表明,对枯草芽孢杆菌生长的影响绵白糖>蔗糖、麦芽糖>葡萄糖>红糖>可溶性淀粉。这与秦艳等在氮源的考察中,李情敏等无机盐在微生物的生长过程中具有调节渗透压、激活酶、维持pH值稳定等作用,在配制培养基时,一般倾向于添加磷酸氢二钾和硫酸镁等物质,可同时提供4种需要量较大的元素。对于其他需要量较少的元素,因在其他天然成分、一般化学试剂、天然水中均以杂质的形式普遍存在,除非特别的研究,一般没有专门添加的必要在选定绵白糖、鱼粉和磷酸氢二钾作为枯草芽孢杆菌生长配方的碳源、氮源和无机盐后,利用单因素试验,确定了3种成分的最佳含量分别为:绵白糖7%,鱼粉4%,磷酸氢二钾0.15%。最后通过正交试验L4.2培养条件确定微生物生长与培养温度、转速、接种量、pH值等条件相关,通过前人的研究结果发现,不同枯草芽孢杆菌的发酵条件不同,培养温度一般为28~37℃,转速为140~220r/min,接种量为2%~10%、初始pH值为5~8,培养时间为12~36h综上所述,立足山东沿海地方经济发展特色,就地取材鱼粉,将其与绵白