用16srdna方法鉴定细菌种属

用16SrDNA方法鉴定细种属(总4页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-CompanyOnel-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除用16SrDNA方法鉴定细菌种属一、实验目的掌握16SrDNA对细菌进行分类的原理及方法；掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。二、实验原理细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。16SrDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80%），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23SrDNA的拷贝数相同。16SrDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16SrDNA鉴定细菌，其技术路线如下：

细菌基因组的提取：■7菌体破碎到胞内可溶物细菌基因组的提取：■7菌体破碎到胞内可溶物分离出DNA―纯化DNAPCR的基本原理:PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93C。左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板―引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。二、操作步骤1、 细菌基因组DNA提取；2、 PCR扩增；3、 细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测；4、 扩增片段回收；5、 DNA片段测序。三、结果处理与分析在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1.02g，放入回收的凝胶后为1.42g,，则凝胶为400mg，因此加入的BindingBuffer为1200^1。我们小组选用B116Ssequence，以下为制作进化树过程：1、根据B116S基因序列，到NCBI上比对，确定其种属（1） NCBI主页（）依次点击进入BLAST（2） 选择nucleotideBLAST（3） 将B1序列复制到文本，框里ChooseSearchSet处点复选按钮others，最后点BLAST（4） 点击BLAST后，数据进行提交。BLAST结果如下：图中“Evalue”指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个（如Totlescore）都是数值越高相似度越高。我组将数据按照Querycover从100%开始从大到小排列，从不同相似度一共选出14组数据。（5）导出数据数据导出格式选择FASTA：（6） 选择大肠杆菌作为外属，导出大肠杆菌（7） 下载MEG并安装，我组使用的是MEGA5.02，并将B1序列导入MEG（8） 通过Edit中的Copy及Paste将B1序列和大肠杆菌序列导入我们选中的14个序列中（9） 选择W中AlignDNA，然后点击OK（10） 选择Date中的MEGAFormat，生成meg文件（11） 打开.meg文件（12） 生成进化树（13） 导出文件，我组导出PDF格式2、进化树Bl应该属于Proteus（变形杆菌属）电泳图谱：四交流与讨论1•细菌中包括有三种核糖体RNA,分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA,rRNA基因由保守区和可变区组成。16SrRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16SrDNA。5SrRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23SrRNA含有的核苷酸数几乎是16SrRNA的两倍，分析较困难。而16SrRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此我们选择16SrRNA进行提纯测序2•用试剂盒提取RNA，—定要注意盒内药品名称，不要弄错3•提取DNA过程中，加入GA缓冲液后，一定要小心吹打混匀，但要注意不要产生气4•制作PCR扩增产物的过程中，第一步要先加水，因为DNA液和其他药品太少，不事先加水，会是使其他样液加到离心管壁上或根本加不进来，造成样液损失。5•我组的DNA电泳虽然亮度略低，但是PCR产物条带清晰明亮，同时并无拖尾现象，说明我组DNA扩增之后含量很高，而且质量也很好6.PCR反应五要素：引物（PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+作为聚合激活剂）。通过这次实验我学到了鉴定细菌种属的一种方法，16SrDNA法，虽然按照试剂盒进行实验操作非常简单，但这次实验的目的并不在于完成一次实验得到实验结果，而在于通过这一次实验学会举一反三，切实地应用到以后的科研实验中去。关于试剂盒的使用，我们不仅要明白如何使用，更要清楚其原理，明白用代称命名的一些试剂的用途以及可能成分，这非常有利于以后的科研工作。同时，操作过程中严格按照步骤进行，注意试剂的使用不要出错。电泳图谱中第一块胶是提完DNA之后、进行PCR之前的样品所跑的电泳条带，能看出条带的表明