饲料中添加壳寡糖对克氏原螯虾消化酶活性、肠道菌群结构及血清非特异性免疫指标的影响

饲料中添加壳寡糖对克氏原螯虾消化酶活性、肠道菌群结构及血清非特异性免疫指标的影响

克里斯科伦、美沙顿和元锚虾通常被称为淡啤酒和小龙虾。在动物学上，它属于节肢动物门、甲壳纲、甲壳素科、元叶虾科和上升虾科。它来自美国和墨西哥，在20世纪30年代从日本传入中国。壳寡糖（chitosanoligosaccharide,COS）是通过甲壳素脱乙酰化的产物壳聚糖（chitosan）降解得到的由2～10个氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的低聚糖。壳寡糖具有多种生理功能，应用比较广泛，具有提高养殖动物生长性能、调节肠道微生态、改善肠道组织形态、影响血液生化指标和增强免疫能力等功能1材料和方法1.1基础饲料的配方及原料壳寡糖购于济南某生物工程有限公司，为黄色粉末状，相对分子质量为3000，脱乙酰基含量≥85%，水分含量≤10%，粗灰分含量≤1%。基础饲料为商品料，颗粒状，购于某生物科技有限公司，主要原料包括大豆粕、鱼粉、菜籽粕、高筋面粉、玉米蛋白粉、氨基酸、维生素、矿物质元素及其络合物等。经二硝基水杨酸（DNS）法1.2试验分组与饲养试验虾购于梁子湖克氏原螯虾养殖基地，试验开始前暂养7d，期间投喂基础饲料，试验开始前禁食24h。养殖试验在华中农业大学水产基地进行，挑选附肢完整、健壮活泼、初始体重为（17.39±1.20)g的克氏原螯虾240尾，随机分为4组，每组3个重复，每个重复20尾虾。各组分别饲喂添加0(C0组，对照组）、200(C200组）、400(C400组）和800mg/kg(C800组）壳寡糖的试验饲料。克氏原螯虾饲养于70.0cm×45.5cm×15.5cm的水族缸中，水族缸内水深约5cm，并放入适当的聚氯乙烯（PVC）管作为隐蔽物。每日于09:00和17:00各投喂1次，投喂量为虾体重的2%～3%，并根据虾当天的摄食状况进行调整，保证饱食。每天虹吸出残饵及粪便，并更换充分曝气的自来水，换水量约为总水量的1/3。试验期间，水温保持在（25±1）℃，溶解氧含量≥6mg/L,pH为7.4～8.2，并使用增氧机连续充氧。试验期14d。1.3样品采集和指标测量1.3.1流动离心检测养殖试验结束后禁食24h。每个重复随机选取6尾虾，分别取其肠道和肝胰腺。将样品称重后，使用移液器吸取4倍于组织块体积的磷酸盐缓冲液（PBS），使用全自动低温组织研磨机充分匀浆后，使用冷冻离心机以2000r/min离心10min，取上清液于4℃冰箱中保存，并于24h内测定。肠道和肝胰腺胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均使用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。1.3.2肠道菌群的测定养殖试验结束后禁食24h。每个重复随机选取3尾虾，使用75%的酒精擦拭消毒，并在无菌操作条件下解剖取出完整的后肠，肠道样品迅速置于液氮中冷冻，随后转移至-80℃冰箱保存，送至上海派森诺生物科技有限公司通过IlluminaMiSeq平台对肠道菌群进行高通量测序。16SrRNA的V3～V4区片段的扩增引物为341F(5′-CCTAY-GGGRBGCASCAG-3′）和806R(5′-GGACTAC-NNGGGTATCTAAT-3′）。对原始数据进行过滤处理并得到优化序列，对获得的序列按97%的序列相似度进行归并和操作分类单元（operationaltaxonomicunits,OTU）划分，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列。基于OTU进行α多样性分析（Simpson指数、ACE指数、Chao1指数和Shannon指数），基于OTU划分和分类地位鉴定结果，进行群落结构的统计分析。1.3.3离心血淋巴制备养殖试验结束后禁食24h。每个重复随机选取10尾克氏原螯虾，使用1mL的无菌注射器从克氏原螯虾头胸甲后方插入心脏取血淋巴，注入1.5mL的离心管中，置于4℃冰箱中静置过夜，使用冷冻离心机以4℃、3000r/min离心10min，取上清液置于-20℃冰箱中备用，并在24h内测定。血清总抗氧化能力（T-AOC）及超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）和过氧化氢酶（CAT）活性均使用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。1.4wssv攻毒试验养殖试验结束后，使用白斑综合征病毒（whitespotsyndromevirus,WSSV）进行攻毒试验。攻毒所使用的WSSV由华中农业大学水产学院病毒实验室提供。每个重复随机取出10尾克氏原螯虾进行攻毒试验，每组共30尾，从每尾克氏原螯虾第2腹节肌肉注射1.0×101.5数据处理与分析试验数据用平均值±标准误表示，使用SPSS22.0软件对试验数据进行处理及单因素方差分析（one-wayANOVA），并采用Duncan氏法进行多重比较，显著性水平为P<0.05。2结果与分析2.1肠道淀粉酶活性如表2所示，饲料中添加壳寡糖能够提高克氏原螯虾肠道及肝胰腺中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性。C200组和C800组的肠道淀粉酶活性显著高于C0组（P<0.05），其中，C200组的肠道淀粉酶活性最高；C200组、C400组和C800组的肠道脂肪酶、胰蛋白酶活性及肝胰腺淀粉酶、脂肪酶活性均显著高于C0组（P<0.05），其中，C200组的肠道脂肪酶活性及肝胰腺淀粉酶活性最高，C800组的肠道胰蛋白酶活性及肝胰腺脂肪酶活性最高；C200组和C400组的肝胰腺胰蛋白酶活性显著高于C0组（P<0.05），其中，C200组的肝胰腺胰蛋白酶活性最高。2.2地壳中的糖对原始海洋肠道菌群结构的影响2.2.1ce指数、shrenon指数如表3所示，C200组的Simpson指数、Chao1指数、ACE指数及Shannon指数均显著高于C0组（P<0.05);C400组的Simpson指数显著低于C0组（P<0.05);C800组的Shannon指数显著低于C0组（P<0.05）。2.2.2各菌门相对丰度的变化各组的肠道菌群结构在门水平上的组成如图1所示，4个组的菌群组成在门水平上，主要由变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、软壁菌门（Tenericutes）、放线菌门（Actinobacteria）等门类组成。各组中变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和软壁菌门的相对丰度均达到90%以上，但是在各组所占比例有所不同。与C0组相比，C200组、C400组和C800组的变形菌门的相对丰度均有所下降，厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门的相对丰度均有所上升。各组的肠道菌群结构在属水平上的组成如图2所示，肠道菌群一共发现404个菌属，其中主要有红细菌属（Rhodobacter）、拟杆菌属（Bacteroides）、沙雷氏菌属（Serratia）、希瓦氏菌属（Shewanella）、乳球菌属（Lactococcus）等菌属。选取各组中相对丰度排名前10位的菌属，并计算其在各样品中的比例如表4所示。在C0组中，红细菌属（40.17%）、乳球菌属（11.67%）、沙雷氏菌属（9.87%）为优势菌属；在C200组中，红细菌属（31.39%）、沙雷氏菌属（20.86%）、拟杆菌属（13.19%）为优势菌属；在C400组中，红细菌属（47.43%）、沙雷氏菌属（13.83%）、拟杆菌属（11.45%）为优势菌属；在C800组中，拟杆菌属（64.66%）、希瓦氏菌属（17.95%）和红细菌属（7.09%）为优势菌属。各组中相对丰度较高并且共有的菌属有红细菌属、乳球菌属、希瓦氏菌属和拟杆菌属，这4个菌属总比例达到60%以上。红细菌属在C400组中比例最高，C800组中比例最低；拟杆菌属在C0组中比例最低，在C200组、C400组和C800组中的比例都有所增加，并在C800组时达到最大；希瓦氏菌属在C800组中的比例最高，在其他各组的比例都有所降低。2.3血清akp活性的比较c00组血清akp活性的相对分子活性c00如表5所示，各组之间血清T-AOC无显著差异（P>0.05);C200组的血清SOD活性显著低于C0组（P<0.05),C400组和C800组的血清SOD活性与C0组无显著差异（P>0.05);C200组、C400组和C800组的血清AKP活性较C0组均有不同程度的提高，其中，C400组和C800组的血清AKP活性显著高于C0组（P<0.05),C200组的血清AKP活性与C0组无显著差异（P>0.05);C400组的血清ACP活性显著高于C0组（P<0.05),C200组和C800组的血清ACP活性与C0组无显著差异（P>0.05);C200组、C400组和C800组的血清CAT活性均显著低于C0组（P<0.05）。2.4下降水平如图3所示，感染WSSV后第7天，克氏原螯虾的累积死亡率随着壳寡糖添加水平的增加而下降。其中，C0组和C200组在第7天的累积死亡率均达到了63.33%,C400组和C800组在第7天的累积死亡率分别为36.67%和26.67%，相较于C0组分别降低了42.10%和57.89%。3讨论3.1寡糖对水产动物肝胰腺及肝胰腺消化酶活性的影响消化酶活性在很大程度上反映出动物从食物中获取营养的能力与效率，进而影响动物的生长发育情况当前，有关于寡糖对水产动物肝胰腺的消化酶活性影响的报道不多，Sang等3.2壳寡糖对克氏原螯虾肠道菌群结构的影响虾类消化道中的细菌大多是通过环境或者食物进入消化道中定植并在此生长繁殖的，并成为了虾类消化道中重要的组成成分，与虾体的健康密切相关。肠道利于细菌定植、环境相对稳定且营养丰富，因此成为消化道内细菌数量最多的一个部位蔡雪峰等本试验中，各组克氏原螯虾肠道菌群结构在门水平上主要由变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和软壁菌门组成，这表明克氏原螯虾的肠道菌群的组成在门水平上具有一定的保守性，但是各个门类分别所占的比例有所变化，说明壳寡糖对克氏原螯虾的肠道结构起到一定的调节作用。张立强等通过对比各组克氏原螯虾肠道菌群中相对丰度前10位的菌属后发现，各组之间只有4种共有菌属，并且各菌属的比例也有较大差别，其比例与壳寡糖添加水平之间的关系并不明显。红细菌属是一种广泛存在于水体中的光合细菌，可以产生各种消化酶，协同动物体本身的消化酶降解饲料中的营养物质并提高免疫力与抗病力3.3壳寡糖对水产动物的抗氧化酶系统甲壳动物体内没有脊椎动物那样的引起特异性免疫的相关因子，因此非特异性免疫在克氏原螯虾的免疫防御中发挥着极其重要的作用。SOD可以清除生物体内多余的自由基，保证动物机体内部的稳态，还在抗衰抗炎方面有着重要的作用。CAT普遍存在于各种动物体内，在生物防御中起着维持氧化还原平衡起着重要的作用。AKP在虾体内主要由肝胰腺产生，在调控代谢方面有着重要的作用关于壳寡糖对水产动物非特异性免疫影响的结果并不一致。陈伟军等3.4wsdv的概念白斑综合征（whitespotdisease,WSD）是严重威胁虾类养殖业持续健康发展的重要疾病之一，其病原为WSSV。WSSV是一种具有囊膜结构的杆状病毒4壳寡糖对克氏原螯虾肠道菌群的影响(1)饲料中添加200mg/kg壳寡糖可以提高克氏原螯虾肠道中的淀粉酶和脂肪酶活性及肝胰腺中的淀粉酶和胰蛋白酶活性，添加800mg/kg可以促进克氏原螯虾肠道中的胰蛋白酶活性及肝胰腺中的脂肪酶活性。(2)饲料中添加壳寡糖可以促进克氏原螯虾肠道中厚壁菌门