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第四章

核酸化学NucleicAcidchemistry第1页第一节概述第二节核酸化学组成第三节核酸分子构造第四节核酸性质第五节核酸研究办法本章内容第2页第一节概述

核酸（nucleicacid—NA）是一类主要生物大分子，担负着生命信息储存与传递。核酸是当代生物化学、分子生物学主要研究领域，是基因工程操作关键分子。第3页1868

F.

Miescher从脓细胞细胞核中分离出了一种含磷酸有机物，当初称为核素（nuclein）,后称为核酸（nucleicacid）。1944

Avery

等通过肺炎球菌转化试验证明DNA是遗传物质。1952Hershey,Chase-噬菌体标识试验。1953

Watson和Crick提出DNA构造双螺旋模型。1958

Crick提出遗传信息传递中心法则。1973Boyer，Cohen-DNACloning(克隆）。1976DNASequencing(序列分析）。1990HumanGenomeProject（人类基因组计划）。一、核酸研究历史第4页光滑型细胞（有毒）粗糙型细胞（无毒）破碎细胞DNAase降解后DNA粗糙型细胞接收光滑型DNA只有粗糙型大多数仍为粗糙型少数光滑型细胞被转化SSRRR+DNA1944年Avery细菌转化试验第5页肺炎球菌（pneumococcus）1928年细菌学家Griffith细菌毒性试验第6页噬菌体感染试验1952年美国Hershey噬菌体感染试验第7页第8页

真核生物

原核生物细胞核（98%）拟核线粒体mDNA

（少许）质粒DNA（plasmid）叶绿体ctDNA

（少许）等病毒DNA

细胞质（90%）细胞质核仁（少许）病毒RNA

二、核酸种类和分布DNA脱氧核糖核酸RNA核糖核酸注：生物细胞都具有DNA和RNA；病毒中只含DNA或只含RNA。第9页第二节核酸化学组成

核酸是由几十个甚至几千万个核苷酸聚合而成具有一定空间构造生物大分子。

基本元素：C、H、O、N、P；其中P含量比较稳定，占9%-10%，通过测定P含量来推算核酸含量（定磷法）。第10页磷酸核苷碱基

戊糖

核酸→核苷酸

第11页一、戊糖

组成核酸戊糖有两种。DNA所含糖为β-D-2-脱氧核糖；RNA所含糖则为β-D-核糖。第12页二、碱基1.嘌呤（Purine）

腺嘌呤AdenineA

鸟嘌呤guanineG第13页2.嘧啶（Pyrimidine）胸腺嘧啶T胞嘧啶C尿嘧啶U第14页

核酸中也存在某些不常见稀有碱基。稀有碱基种类很多，大部分是上述碱基甲基化产物。二氢尿嘧啶（DHU）第15页修饰碱基简写符号

(为1时能够不写)第16页三、核苷（nucleoside）核苷：戊糖+碱基

糖与碱基之间C-N键，称为C-N糖苷键核苷中戊糖与碱基连接方式：1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)第17页修饰核苷/稀有核苷修饰核苷包括三种情况:

（1）由修饰碱基和糖组成核苷（2）由非修饰碱基和2'-O-甲基核糖组成核苷（3）由碱基与糖连接方式特殊核苷

第18页（1）（2）二氢尿嘧啶核苷

(Am)第19页（3）(ψ)第20页取代基用下列小写英文字母表达:甲基m乙酰基ac氨基n甲硫基ms羟基o或h硫基s异戊烯基i羧基c第21页例：第22页四、核苷酸（nucleotide）

核苷酸：核苷+磷酸

戊糖+碱基+磷酸

H第23页五、游离核苷酸及其衍生物形式1.继续磷酸化第24页2.环化磷酸化

cAMP

cGMP第25页3.辅酶

NAD、NADP、FAD、HSCoA

FADNAD、NADPHSCoA第26页4.GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白

生物合成和多糖生物合成活性糖

基供体。

第27页第三节核酸分子构造一、DNA构造一级构造:DNA核苷酸链中脱氧核苷酸组成和排列次序。二级构造：DNA两条多聚链间通过氢键形成双螺旋构造。三级构造：DNA双链深入折叠卷曲形成构象。第28页（一）DNA一级构造

由dAMP、dGMP、dCMP、dTMP核苷酸单体通过3’,5’-磷酸二酯键相连而成链状聚合物。5’5’3’3’第29页构造式5′-磷酸端（常用5′-P表达）；3′-羟基端（常用3′-OH表达）核苷酸链具有方向性，当表达一种核苷酸链时，必须注明它方向是5′→3′或是3′→5′。第30页字母式5′PAPCPGPCPTPGPTPAOH3′

5′PACGCTGTAOH3′线条式OH第31页DNA一级构造也可指DNA分子中碱基次序。DNA碱基次序本身就是遗传信息存放分子形式。生物界物种多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化不一样排列组合之中。第32页（二）DNA二级构造Watson和Crick于1953年提出了DNA双螺旋构造模型，说明了DNA二级构造。（即B型DNA）第33页（1）Chargaff定则

（1950s,E.Chargaff发觉）DNA碱基组成符合：A=T；G=C；

A+G=T+C。不对称比率：A+T/G+C；物种不一样，DNA碱基组成不一样；物种亲缘愈接近，碱基组成也愈接近，该比率越相近似。Ⅲ.具有种特异性，没有器官和组织特异性，年纪、营养情况、环境变化不影响DNA碱基组成。1．提出DNA双螺旋构造模型根据

第34页第35页（2）x-光衍射分析20世纪40年代Astbury1952年M.Wilkins第36页2．DNA双螺旋构造模型（double-helicalstructure）1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋构造。第37页DNA双螺旋构造模型重点（1）螺旋中两条链反向平行，即其中一条链方向为5′→3′，而另一条链方向为3′→5′，两条链共同围绕一种假想中心轴呈右手双螺旋构造。第38页DNA双螺旋构造模型重点（2）疏水碱基位于双螺旋内侧，亲水磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基平面与螺旋轴垂直，脱氧核糖平面与中心轴平行。由于几何形状限制，碱基对只能由嘌呤和嘧啶配对，即A与T，G与C。这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。第39页T-A碱基对C-G碱基对第40页DNA双螺旋构造模型重点（3）由于碱基对排列方向性，使得碱基对占据空间是不对称，因此，在双螺旋表面形成大小两个凹槽，分别称为大沟和小沟，二者交替出现。2.0nm小沟大沟第41页DNA双螺旋构造模型重点（4）双螺旋横截面直径约为2nm，相邻两个碱基平面之间距离（轴距）为0.34nm，每10个核苷酸形成一种螺旋，其螺距（即螺旋旋转一圈）高度）为3.4nm。2.0nm小沟大沟第42页DNA双螺旋构造模型重点（5）两条链借碱基之间氢键和碱基堆积力（即碱基之间范德华力）牢靠连接起来，维持DNA双螺旋三维构造。两条链是碱基互补关系。第43页3.DNA双螺旋构造稳定原因

氢键

碱基堆积力

磷酸基上负电荷被胞内组蛋白或正离子中和

碱基处于疏水环境中第44页4.DNA双螺旋构造意义

该模型揭示了DNA作为遗传物质稳定性特性，最有价值是确认了碱基配对标准，这是DNA复制、转录和反转录分子基础，亦是遗传信息传递和体现分子基础。该模型提出是上个世纪生命科学重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展基石。第45页DNA双螺旋构象类型第46页（三）DNA三级构造---超螺旋1）超螺旋是指双螺旋进一步扭曲或再螺旋构象。2）正超螺旋（变紧，过旋）和负超螺旋（变松，欠旋）。3）人类46条染色体DNA总长可达1.7m，通过螺旋化压缩，实际总长只有200nm。第47页负超螺旋第48页核小体盘绕及染色质示意图第49页DNA存在形式--核小体真核生物中DNA双螺旋沿着组蛋白八聚体关键短轴绕1.75圈，形成左手超螺旋，称核小体。染色质基本构造单位是核小体。串珠状构造深入卷曲形成螺线管，后者再深入卷曲形成超螺旋管，形成染色单体。第50页基因和基因组基因即一段有功能DNA片段，生物细胞中DNA分子最小功能单位（交换单位）。一种细胞或生物体所含全套基因称基因组。第51页二、RNA分子构造（一）RNA分类及特点（二）

RNA分子构造特点

第52页（一）RNA特点及分类构造特点：1.碱基组成：A、G、C、U（A＝U/G≡C）；2.稀有碱基较多，稳定性较差，易水解；3.多为单链构造，少数局部形成螺旋（发夹构造）；4.分子较小。分类：1.信使RNA（mRNA）2.转运RNA（tRNA）3.核糖体RNA（rRNA）第53页MessengerRNA约占总RNA3%-5%，含量最少，种类最多。成熟mRNA不含内含子，hnRNA具有。mRNA从DNA转录遗传信息，并作为蛋白质合成模板，决定蛋白质氨基酸次序。第54页RibosomeRNA

约占所有RNA80%，含量最多。与多种蛋白质结合成核糖体，后者是合成蛋白质场所。第55页原核生物真核生物核糖体rRNA核糖体rRNA

30s70s

50s16s5s、23s40s80s50s18s5s、5.8s、28s第56页TransferRNA约占总RNA10-15%，分子最小。它在蛋白质生物合成中起翻译mRNA信息，并将对应氨基酸转运到核糖体，参与蛋白质体合成。已知每一种氨基酸最少有一种对应tRNA。第57页（二）RNA分子构造特点tRNA构造第58页二级构造特性：单链三叶草叶形四臂四环三级构造特性：在二级构造基础上深入折叠扭曲形成倒L型第59页酵母tRNAAla

二级构造

DHU环IGC反密码子反密码环氨基酸臂可变环TψC环CCAAla3´5´第60页2）rRNA分子构造特性：

单链，螺旋化程度较tRNA低

与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能5SRNA二级构造第61页3）mRNA分子构造在转录一章讲授第62页第四节核酸性质一、一般物理性质二、核酸水解三、两性解离四、紫外吸取性质五、稳定性六、变性七、复性与杂交第63页一、一般物理性质1.DNA白色纤维状固体，RNA白色粉末状固体，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇来沉淀DNA；DNA溶液黏度大于RNA。2.DNA难溶于0.14mol/LNaCl溶液，可溶于

1—2mol/LNaCl溶液，RNA则相反，可据此分离二者。3.加热条件下，

D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚绿色

D－2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺蓝紫色第64页二、核酸水解核酸分子中磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。DNA和RNA对酸或碱耐受程度有很大差异。室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解。在细胞内核酸分子受DNA酶作用。第65页三、两性解离核酸含酸性磷酸基团，又含弱碱性碱基，为两性电解质，可发生两性解离；核酸相称于多元酸，pH大于4时，呈阴离子状态；等电点第66页四、紫外吸取在核酸分子中嘌呤碱和嘧啶碱都具有共轭双键体系，在260nm有吸取；能够作为区分蛋白质和对核酸及其组份定性和定量测定根据，进行核酸纯度判定，也可作为核酸变性和复性指标。第67页DNA紫外吸取光谱天然DNA变性DNA核苷酸总吸取值1232202402602800.10.20.30.4波长（nm）光吸取123第68页根据A260/A280比值判断核酸样品纯度纯DNA：A260/A280=1.8纯RNA：A260/A280=2.0（若样品中具有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值显著减少）纯核酸样品可根据260nm光吸取值算出其含量若260nm光吸取值为1相称于50μg/ml双螺旋DNA或相称于40μg/ml单链DNA或RNA或相称于20μg/ml寡核苷酸。第69页五、DNA稳定性1.DNA溶液呈粘稠状，但事实上DNA双螺旋构造僵直而有刚性，易断成碎片，这也是目前难以取得完整大分子DNA原因。2.溶液状态DNA易受DNA酶作用而降解，抽干水分DNA性质十分稳定。第70页六、DNA变性1.概念2.变性条件3.变性特性第71页1.概念是指核酸双螺旋区多聚核苷酸链间氢键断裂，变成单链构造过程。第72页2.DNA变性条件能够引发核酸变性原因有：1）温度升高；2）酸碱度变化、pH（>11.3或<5.0）；3）有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺等；4）低离子强度。第73页3.DNA变性特性变性核酸将失去其部分或所有生物活性。变性变化了DNA二级构造。核酸变性并不包括磷酸二酯键断裂，因此它一级构造(碱基次序)保持不变。DNA变性过程是突变性，它在很窄温度区间内完成。DNA解链温度紫外吸取值显著增加，即增色效应。粘度减少，沉降系数增加。第74页DNA解链温度（熔点，Tm

）当50%DNA变性时温度称为该DNA解链温度，即增色效应达成二分之一时温度；一般DNATm值在70-85

C之间。均一DNA（如病毒）Tm值范围较小。分子中G和C含量越高，越不易变性，Tm值越高。可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44Tm值随溶液盐浓度增加而增大，

Tm值较低，易变性，不易保存。第75页溶解曲线与Tm。。第76页影响Tm值原因

①DNA均一性

②DNA中G-C对含量

经验式:(G-C)%=(Tm-69.3)×2.44③盐离子强度第77页增色效应与减色效应

天然DNA分子在热变性条件下，双螺旋构造破坏，碱基暴露，在紫外光260nm波长处吸取度显著增加，此现象称为增色效应。变性DNA分子复性形成双螺旋构造时其紫外吸取减少现象称为减色效应。第78页第79页七、DNA复性概念复性条件3.影响复性原因4.复性动力学5.分子杂交第80页1.概念1.变性DNA在合适条件下，两条彼此分开单链能够重新缔合成为双螺旋构造，其物理性质和生物活性随之恢复，这一过程称为复性；2.对于热变性DNA，在迟缓冷却条件下可重新结合恢复双螺旋构造，称为退火。3.DNA复性后，一系列性质将得到恢复，不过生物活性一般只能得到部分恢复。第81页DNA复性图示第82页2.DNA复性条件1.将热变性DNA骤然冷却至低温时，DNA不也许复性。即淬火。2.将变性DNA迟缓冷却时，能够复性。退火温度＝Tm－25℃3.分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。另外，DNA复性需要一定盐浓度，也与它本身组成和构造有关。第83页高于Tm值5℃

复性也称退火

第84页3.影响复性原因

①样品性质

②DNA浓度

③DNA片段大小

④温度

⑤离子强度

第85页4.复性动力学

DNA复性过程是一种双分子反应S：singlestrandDNA

D：doublestrandDNA

第86页Cot:时Cot值，即指复性完成二分之一时Cot值。第87页5.分子杂交1.在变性DNA溶液中加入外源DNA单链分子或RNA单链分子（与原DNA具有同源性），去掉变性条件后复性形成双螺旋构造过程。2.这样形成新分子称为杂交DNA分子。3.利用核酸杂交可检测特定核苷酸片段或研究同源性等。第88页分子杂交

探针：用于杂交异源DNA或RNA序列，其核苷酸序列是人工特定、已知，经放射性标识一条链。第89页核酸变性、复性和杂交变性（加热）探针杂交（迟缓冷却）复性（迟缓冷却）第90页分子杂交种类SouthernBlot：DNA-DNA杂交NorthernBlot：DNA-RNA杂交WesternBlot：抗原-抗体进行杂交原位杂交：活体组织上进行杂交，显出荧光第91页Southern印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标识DNA探针杂交放射自显影带有DNA片段凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段膜第92页第五节核酸研究办法

一、核酸分离、提取通则

为了得到完整大分子核酸，一般要注意3点：1．保持低温（0º～4℃）。2．避免过酸、过碱，避免剧烈搅拌。3．避免核酸酶作用。

第93页抑制DNase：

可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂十二烷基硫酸钠