共聚焦专业知识讲座

激光扫描共聚焦显微技术Laserscanningconfocalmicroscopy主讲教师：林叶副专家第1页实验目理解激光扫描共聚焦显微镜硬件组成；理解激光扫描共聚焦显微镜基本操作；理解激光扫描共聚焦显微镜在生命科学领域应用。第2页什么是激光扫描共聚焦显微镜？以激光作为激发光源，采取光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以取得高辨别率光学切片荧光显微镜系统。第3页激光扫描共聚焦显微镜硬件组成光学显微镜激光光源扫描模块（共聚焦光路通道针孔、扫描镜）光检测器计算机系统（数据采集、处理、转换）图形输出设备第4页NikonA1R激光扫描共聚焦显微镜第5页ZeissLSM510激光扫描共聚焦显微镜第6页LeicaTCSSP2激光扫描共聚焦显微镜

激光光源及控制装置共聚焦扫描和检测装置防震台第7页显微镜第8页第9页第10页第11页激光扫描共聚焦显微镜第12页激光作为光源；具有多种荧光通道，可同步探测多种被标识物；具有光源针孔和检测针孔，光源针孔和检测针孔共轭（共焦），共焦点即被探测点，被探测点所在平面为共焦平面；逐点扫描成像。激光扫描共聚焦显微镜设计特点

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激光器

——多谱线激光光源

UV激光器：351nm364nm

半导体激光器：405nm

氩离子激光器：457nm

477nm488nm

514nm

氦氖绿激光器：543nm

氦氖红激光器：633nm第14页第15页第16页第17页逐点扫描成像第18页ZOOMIN

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激光共聚焦显微技术在生命科学研究中应用第20页

一拍摄多重荧光影像

通过一种或多种荧光探针标识后，可对固定组织或活体样本进行亚细胞水平构造功能研究。蛋白质体现定位细胞器定位研究第21页第22页奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18体现细胞核PI标识（red）角蛋白18FITC标识（green）第23页第24页妊娠3个月奶山羊乳腺上皮细胞主要细胞器变化ER.内质网；M.线粒体；N.核奶山羊乳腺上皮细胞中细胞器第25页通过序列光切功能，可取得标本真正意义上三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真三维效果，可进行形态学观测，并揭示亚细胞构造空间关系。二、三维立体影像重建

第26页Z轴光切第27页第28页第29页第30页细胞内离子探针钠离子探针：SBFI

钾离子探针：PBFL-2

镁离子探针：mag-fura-2钙离子探针：Fluo-3三、细胞内物质动态观测及定量分析第31页Ca2+

成像，时间序列（Fluo3-AM）第32页胞浆细胞核第33页第34页植物细胞中过氧化氢含量伴随盐胁迫时间进程变化（图片时间间隔5min）第35页植物细胞膜点位去极化随盐胁迫时间进程变化（红色荧光深度代表去极化程度）第36页四.荧光漂白恢复生物膜脂质分子侧向扩散检测细胞连接间信息传递胞浆及细胞器内小分子物质转移观测第37页荧光漂白第38页卵细胞局部荧光漂白第39页第40页五、荧光共振能量转移用于研究蛋白质-蛋白质之间互相作用荧光共振能量转移条件：两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2供体与受体距离在2-7nm，伴随距离延长,FRET呈显著削弱.供体发射波长与受体激发波长一致第41页第42页试验成果

奶牛乳腺上