微生物的染色

试验一显微镜使用及细菌,放线菌和蓝细菌个体形态观察(一)目标(1)掌握显微镜结构,原理,学习显微镜操作方法和保养.(2)观察细菌,放线菌和蓝细菌个体形态,学会生物图绘制.(二)试验器材(1)显微镜,目测微计,物测微计,擦镜纸,香柏油,二甲苯.(2)示范片大肠杆菌小球菌蓝藻等微生物的染色第1页（二）、试验内容

1.显微镜结构（1）.机械部分

（2）.光学部分

微生物的染色第2页微生物的染色第3页（2）光学部分

a.目镜

b.物镜:低倍物镜高倍物镜油镜

物镜性能由数值孔径决定数值孔径=n*sina/2

显微镜性能还依赖于物镜分辨力

分辨力:能分辨两点之间最小距离能力增大数值孔径来提升分辨力.

物镜N.A.1.25,100*,”OI”,160/0.17,16mm----N.A.1.25数值孔径100*放大倍数”OI”油镜160镜筒长0.17要求盖玻片厚度16mm焦距

C.聚光器

d.反光镜

f.滤光片

微生物的染色第4页2.显微镜使用和保护(1)低倍镜使使用方法

(2)高倍镜使使用方法

(3)油镜使使用方法

3.目测微尺,物测微尺及其使用方法

(1)目测微尺

(2)物测微尺

(3)目测微尺标定

(4)菌体大小测量

4.细菌,放线菌和蓝细菌个体形态观察

(四)试验汇报微生物的染色第5页微生物的染色第6页试验三微生物直接计数法

(一)目标（1）明确显微镜计数原理．（2）学习使用血球计数板进行微生物计数方法（二）仪器与材料显微镜血球计数板移液管酵母菌液（三）血球计数板结构与计算方法（1）16＊25计数板计算公式细胞数／ｍｌ＝125小格内细胞数＊400＊10＊1000＊稀释倍数／125（2）25＊16计数板计算公式细胞数／ｍｌ＝80小格内细胞数＊4＊10＊1000＊稀释倍数／80微生物的染色第7页四）操作步骤

（1）稀释样品使每格约5个细胞

（2）取洁净血球计数板，用厚盖玻片盖住中央计数室，用移液管吸收少许充分摇匀待测菌液于盖片边缘，菌液则自行渗透计数室，5～10min即可计数

（3）将血球计数板置于载物台上，用低倍物镜找到小方格网后换用高倍镜观察计数

每样品重复三次，取平均值，计算每1ml菌液中所含酵母菌数。

（五）试验汇报

微生物的染色第8页试验四微生物染色目标

学习微生物涂片染色操作技术,掌握微生物普通染色法(单染色法)和革兰氏染色法试验仪器和材料试验步骤单染色革兰氏染色微生物的染色第9页涂片干燥固定染色水洗吸干镜检微生物的染色第10页

取大肠杆菌和枯草杆菌芽孢杆菌(均以无菌操作)分别做涂片,干燥,固定.方法同单染色法用草酸铵结晶紫染色1min,水洗.

加革氏碘液媒染色1min,水洗斜置载玻片于一烧杯上,滴加95%酒精脱色,至流洗出酒精不展现紫色时,马上用水冲净酒精,脱色时间约20min,或视涂片厚薄而略有差异用番红(或称沙黄)染液染色1~2min,水洗吸干,置于显微镜下观察,阳性者为紫色,阴性者为红色革兰氏染色关键在于严格掌握酒精脱色程度.如脱色过分,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应微生物的染色第11页试验五培养基制备及灭菌一目标

1玻璃仪器洗涤和灭菌前准备工作

2掌握培养基配制方法

3会干热灭菌和高压蒸汽灭菌操作方法二试验材料三试验内容

1玻璃器皿洗涤剂包装

A洗涤培养皿、试管、锥形瓶等可用去污粉或肥皂，自来水冲净。移液管用洗液浸泡在水冲净。干燥。微生物的染色第12页B包装

1）培养皿牛皮纸包装

2）吸管吸端塞棉花约1~1.5cm，(防细菌吸入口中，防止细管吹入)，松紧适宜。用包装纸包移液管尖端。

3）试管和锥形瓶等管口均堵棉塞，并用牛皮纸包裹。微生物的染色第13页2培养基制备

A步骤

1）配制溶液取一定容量烧杯盛入定量无菌盐水，按培养基配方逐一称取各成份，加水溶解，可加热促进，不停搅拌以防原料在杯底烧焦。

2）调pH值测定培养液pH,按要求以10%HClor10%NaOH调至所需pH。

3）过滤用纱布、滤纸、棉花均可，若杂质少可省略微生物的染色第14页4）分装将培养基分装在试管或锥形瓶中（放置培养基玷污管口，防止浸湿棉塞引发杂菌污染），装入试管量视1试管大小定，普通斜面培养基时为其高度1/4~1/35）斜面培养基制作将装有琼脂培养基已灭菌试管趁热取出，斜置于木棒上，使其斜面长度为试管1/3~1/2，代培养基凝固后即成斜面微生物的染色第15页B营养琼脂培养基制备1）培养基配方：牛肉膏0.75g，蛋白胨1.5g，氯化钠0.75g，琼脂3g，蒸馏水150ml，pH7.6。0.1Mpa下灭菌20min.2）操作：a取300ml烧杯一个，装150ml蒸馏水。

b在药品天平上一次称取配方中各成份，水中溶解，带待琼脂完全溶解后停顿加热，补充水分，用10%NaOH调pH=7.6，省略过滤，培养基分装五支试管中，余入250ml锥形瓶，塞上棉塞，包炸好待灭菌3无菌水制备1）取250ml锥形瓶装90ml蒸馏水，赛棉塞，包扎，待灭菌2）取5支18mm*18mm试管，分装9ml蒸馏水………4灭菌杀死全部微生物营养细胞和它们芽孢或孢子微生物的染色第16页灭菌方法过滤除菌，化学药品消毒，利用酚、甲醛等是细菌蛋白质变性灭菌；高温，紫外线等物理方法加热灭菌是主要：干热灭菌，高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）。后者在121oC灭菌15~30min,效果好。1）干热灭菌法：用于培养皿等玻璃仪器。包装好上述物品放入恒温箱中，160oC维持2h，旋钮调至零，到50oC可取2）高压蒸汽灭菌：微生物试验所需仪器培养基，皆可用高压灭菌锅灭菌微生物的染色第17页2）灭菌操作过程

A先加水，放物品，盖锅盖，对称拧紧螺栓，防漏气。

B加热，并开排气阀，冒热气3~5min后关。到所需压力计时，达灭菌时间后停顿加热

C压力为零开排气阀，取物

D将灭菌后培养基于37oC恒温箱24h，作无菌培养，若无菌生长，可保留备用。微生物的染色第18页试验六微生物纯种分离、培养和接种技术一目标要求掌握倒平板方法和几个分离纯化微生物基本要求二仪器材料三操作方法及步骤

1微生物纯种分离及培养：稀释平板法和平板划线法

1）稀释平板法

a取样用无菌锥形瓶取定量会活性污泥

b稀释水样将一瓶90毫升和5管9毫升无菌水按10-1

至10-6依次编号。无菌条件下用10ml移液管取10ml水样于第一瓶90ml无菌水中，摇匀即得10-1浓度菌液。移液管吹洗3次微生物的染色第19页用1ml无菌移液管取1ml10-1浓度菌液于9ml无菌水中摇匀。同法，依次稀释至10-6C平板制作将10套无菌培养皿编号10-410–510-6按次序分别取0.5ml菌液于对应培养皿（吸前移液管吹使其混匀）。同时加热琼脂培养基，熔化，冷至45oC时，注10~15ml入培养皿。马上盖盖，混匀，冷却后即成平板。将培养基倒置于30恒温箱中培养，48h后观察结果微生物的染色第20页（2）平板划线分离法

a制作:将熔化冰凉至50oC营养琼脂培养基

10~15ml

导入无菌培养皿，凝固成平板

b划线：以无菌操作，接种环挑污泥于在平板上划线，盖盖，倒置于30oC恒温箱培养48h后观察结果2其它接种方法操作1）斜面接种技术A贴标签B点燃酒精灯C将一支斜面菌种和一支待接种斜面培养基放左手，拇指压住两试管，中指于其间，斜面向上，管口齐平。D接种环灭菌微生物的染色第21页微生物的染色第22页E将棉花拔出，试管口微绕火焰。用接种环快速移菌种于另一试管底部，再接种环上有底部向上画曲线。接种环灭菌。2）液体接种由斜面基接种到液体培养基。用接种环将菌种全送入液体培养基，塞棉花，转动使其混匀。3）液体培养基中菌种被接入液体培养基用无菌移液管自菌种管吸收菌液接种到另一液体培养基中赛好棉塞即可4）穿刺接种将斜面培养基接种到固体或半固体深层培养基自中心刺入，直到管底，但不穿透，并沿穿刺路径拔出，易于观察。微生物的染色第23页试验七纯培养菌中菌体、菌落形态观察一目标观察菌形态及菌落特征，经过革氏染色了解活性污泥有哪些微生物组成。二仪器材料三试验内容与方法1菌落形态和菌体染色及其形态观察A接种斜面培养基B菌落形态特征观察酵母菌菌落圆形，大小靠近细菌，光滑，质地软，多为白色和红色。放线菌洛硬度大，干致密，与基质结合紧。酶菌菌落呈绒状或棉状，能扩散生长，疏松。微生物的染色第24页在液体培养基上观察混浊度，有没有沉淀，液体表面生膜与否，膜形状等；在斜面培养基上，观察菌落生长旺盛程度，形状，颜色，及光泽等在穿刺接种时看菌落在基质表面情况，菌落延伸及是否液化培养基和液化情况。观察时绘出菌落形态特征图3）微生物个体形态观察观察各种微生物菌落形态后，革氏染色，镜检，绘其形态图。2细菌，放线菌，酵母菌及霉菌菌落特征比较四试验汇报五思索题微生物的染色第25页微生物的染色第26页试验八水中大肠菌群检测目标

学习水中大肠菌群检测原理和方法仪器和材料样品培养基染料其它原理操作方法与步骤多管发酵法滤膜法微生物的染色第27页大肠菌系以大肠埃希氏菌为主需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌,在世界范围内370c生长时,能于48h内发酵乳糖使产酸产气.主要包含埃希氏菌属,肠杆菌属,克雷伯氏菌属等.因为其在水体中存在数目与肠道致病菌呈一定正相关,抵抗力也略强,且易于检验等特点,在水质检测中常将其作为水体受粪便污染指标,如我国生活饮用水卫生标准中即要求1L水样中大肠菌群数不超出3个.大肠菌群也称为粪便污染指示菌.苏检验方法有我管发酵法及滤膜法两种.多管发酵法可适合用于各种水样,试验周期较长;滤膜法则适合用于杂技较少水样,尤其适合用于自来水厂作为常规监测之用.微生物的染色第28页

取水样自来水样采集河湖、井水、海水水样采集水样处置初步发酵试验复发酵试验微生物的染色第29页微生物的染色第30页准备工作滤膜灭菌滤膜过滤器安装

过滤水样

观察结果挑取符合大肠菌群菌落特征菌落进行革兰氏染色，镜检。将镜检验员革兰氏服性、无芽孢杆菌菌落再接种一支乳糖蛋白胨发酵管，经370c培养24h，产酸又产气者即为大肠菌群阳性计算1L水样中大肠菌群数=