酶类药物专题知识讲座

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第一节酶类药品原料起源

一、原料选择选取原料应注意以下几点:（1）不一样酶用料选择：哪里有，含量高，选哪。（2）注意不一样生长发育情况及营养情况,

用微生物制酶，故需测其活力来决定取酶阶段。用动物器官提取酶，则与动物年纪及喂养条件相关。酶类药物专题知识讲座第2页（3）从原料起源是否丰富考虑；从简化提纯步骤着手。（4）如用动物组织作原料，则此动物宰杀后应马上取材。从动物或植物中提取酶受到原料限制，伴随酶应用日益广泛和需求量增加，工业生产重点已逐步转向微生物。用微生物发酵法生产药用酶，不受季节、气候和地域限制，生产周期短，产量高，成本低，能大规模生产。酶类药物专题知识讲座第3页二、微生物酶制剂高产菌株选育菌种是工业发酵生产酶制剂主要条件。与增加品种、缩短生产周期、改进发酵和提炼工艺条件等亲密相关。优良菌种取得有三条路径：①是从自然界分离筛选：②是用物理域化学方法处理、诱变；③是用基因重组与细胞融合技术。所以微生物分离筛选是一切工作基础。酶类药物专题知识讲座第4页三、微生物酶制剂生产发酵技术首先要合理选择培养方法、培养基、培养温度、pH和通气量等。还要研究酶分离提纯技术和制备工艺。（—）原料利用微生物生产酶制剂主要原料为碳源和氮源，另外还有无机盐、生长原因和产酶促进剂等。酶类药物专题知识讲座第5页

假如添加少许某种物质就能显著增加酶产量时，这类物质通称为产酶促进剂。它们大多属于酶诱导物或表面活性剂。1、固体培养法固体培养法亦称麸曲培养法，该法是利用麸皮或米糠为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼等，加水拌成含水适度半固态物料作为培养基。2、液体培养法液体培养法是利用液体培养进行微生物生长繁殖和产酶。依据通气（供氧）方法不一样，又分为液体表面培养和液体深层培养两种。酶类药物专题知识讲座第6页3、影响酶产量原因

菌种产酶性能是决定发酵效果主要原因，不过发酵工艺条件对产酶影响也是十分显著。（1）温度普通发酵温度比种子培养时略高些，这么对产酶有利。（2）pH可用糖或淀粉调整，pH低则可用氨来调整。酶类药物专题知识讲座第7页（3）通气（供氧）临界氧浓度。氧必须是溶解于培养基中氧。（4）搅拌增加液体湍流速度，降低气泡周围液膜厚度。有利于促进细胞新陈代谢。（5）泡沫和消沫剂因为培养基中蛋白质分子排在气泡表面形成一层吸附膜，聚集成泡沫层之故。（6）添加诱导剂和抑制剂诱导酶诱导酶合成，诱导酶是该酶作用底物或者是其类似物。抑制剂促进酶形成。加入适量表面活性剂。酶类药物专题知识讲座第8页第二节酶类药品提取和纯化一、生物材料预处理（一）动物材料预处理1、机械处理用绞肉机绞，普通细胞并不破碎。有酶必须细胞破碎后才能有效地提取，在试验室常见是玻璃匀浆器和组织捣碎器。2、重复冻融

冷到-10℃左右，再迟缓溶解至室温，如此重复屡次。因为细胞中冰晶形成，及剩下液体中盐浓度增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使一些酶释放出来。酶类药物专题知识讲座第9页3、丙酮粉组织经丙酮快速脱水干燥制成丙酮粉，不但可降低酶变性，同时因细胞结组成份破碎使蛋白质与脂质结合一些化学键打开，促使一些结合酶释放到溶液中，常见方法是将组织糜或匀浆悬浮于0.0lmol／L，pH6.5磷酸缓冲液中，在0℃下一边搅拌，一边渐渐倒入10倍体积-15℃无水丙酮内，10分钟后，离心过滤取其沉淀物，重复用冷丙酮洗几次，真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低温下可保留数年。酶类药物专题知识讲座第10页（二）微生物预处理要是酶是胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。但对胞内酶则需将菌体细胞破壁，制成无细胞悬液后再行提取。菌体用生理盐水洗涤除去培养基后，应深冻保留。

1、干燥法：

干燥常能造成细胞自溶，增加酶释放，从而在后处理中破壁无须太猛烈就能到达预期目标。①空气干燥25～30℃

②真空干燥还原剂作保护剂

③冷冻干燥对较敏感酶宜用此法。

2、机械法：常见方法有研磨法，组织匀浆法，超声波法，高压匀浆法等。酶类药物专题知识讲座第11页3、酶法处理用得最多是溶菌酶，如在37℃，pH8.0下对小球菌进行破壁处理，历时15分钟，即可提取核酸酶。也有用脱氧核糖核酸酶处理，操作与溶菌酶同。二、酶提取1、水溶液法常见稀盐溶液或缓冲液提取。普通在低温下操作。在酸性条件下稳定酶要在酸性条件下提取。普通来说，碱性蛋白酶用酸性溶液提取，酸性蛋白酶用碱性溶液提取。酶类药物专题知识讲座第12页

盐浓度普通以等渗为好，相当于0.15mol／LNaCl离子强度是最适宜于酶提取。2、有机溶剂法一些结合酶如微粒体和线粒体膜酶，因为和脂质牢靠结合，为此必须除去结合脂质，且不能使酶变性，最常见有机溶剂是丁醇。

3、表面活性剂法表面活性剂能与蛋白质结含而分散在溶液中，故可用于提取结合酶。酶类药物专题知识讲座第13页三、酶制剂工业提取法（一）发酵液预处理及过滤微生物发酵液分离，过滤，发酵液中加絮凝剂或凝固剂。絮凝剂有聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷氨酸。（二）酶液脱色活性炭、脱色树脂。（三）盐析法用得最多是（NH4）2SO4，在常温下不会造成酶失活，若分级沉淀应用得当，杂蛋白杂质也较少。酶类药物专题知识讲座第14页（四）有机溶剂法

有机溶剂沉淀蛋白质能力为丙酮＞异丙醇＞乙醇＞甲醇。工业上通常采取乙醇作为沉淀剂。（五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂喷雾干燥用于干燥菌体，药用酶常见冷冻干燥。四、酶纯化评价纯化工艺主要看二个指标，一是酶比活，二是总活力回收。

酶类药物专题知识讲座第15页酶在纯化过程中一些技术难点：（一）杂质除去酶提取液中，除所需酶外，还含有大量杂蛋白、多糖、脂类和核酸等。（1）pH和加热沉淀法

（2）蛋白质表面变性法利用蛋白质表面变性性质差异，也可除去杂蛋白，加入氯仿和乙醇进行震荡，能够除去杂蛋白。酶类药物专题知识讲座第16页（3）选择性变性法

利用蛋白质稳定性不一样，除去杂蛋白。甚至可用2.5%三氯乙酸处理。（4）核酸沉淀剂法用核酸酶，将核酸降解成核苷酸，使粘度下降便于离心分离。用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等。（5）将酶与底物结合酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，热稳定性大大提升，这么就可用加热法除去杂蛋白。酶类药物专题知识讲座第17页（二）脱盐和浓缩1、脱盐脱盐方法是透析和凝胶过滤。2、浓缩酶浓缩方法很多，有冷冻干燥、离子交换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水等。（三）酶结晶把酶提纯到一定纯度以后（通常纯度应达50%以上），可使其结晶，酶纯度经常有一定程度提升。为研究蛋白质空间结构提供X射线衍射样品。酶类药物专题知识讲座第18页1、酶结晶方法酶结晶方法主要是迟缓地改变酶蛋白溶解度，使其略处于过饱和状态。（1）盐析法

操作要在低温下进行，加盐，缓冲液pH要靠近酶等电点。多数酶就可形成结晶。有时也可交替置在4℃冰箱中和室温下来形成结晶。（2）有机溶剂法

酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶形成结晶。普通要含少许无机盐情况下，选择使酶稳定pH，迟缓地滴加有机溶剂。使用缓冲液普通不用磷酸盐，而用氯化物或乙酸盐。酶类药物专题知识讲座第19页（3）复合结晶法有时能够利用一些酶与有机化合物或金属离子形成复合物或盐性质来结晶。（4）透析平衡法（5）等电点法2、结晶条件选择（1）酶纯度酶纯度越高，结晶越轻易，长成大单晶可能性也越大。结晶对酶有显著纯化作用。（2）酶浓度（3）温度结晶温度通常在4℃下或室温25℃下，低温条件下酶不但溶解度低，而且不易变性。酶类药物专题知识讲座第20页（4）时间结晶形成时间,数小时到几个月，有甚至需要1年或更长时间。普通来说，较大而性能好结晶是在生长慢情况下得到。普通希望使微晶形成快些，然后慢慢地改变沉淀条件，再使微晶慢慢长大。（5）pH

调整pH可使结晶长到最正确大小，也可改变晶形。结晶溶液pH普通选择在被结晶酶等电点附近。（6）金属离子

许多金属离子能引发或有利于酶结晶，在酶结晶过程中常见金属离子有Ca2+、Zn2＋、Co2＋、Cu2＋、Mg2＋、Mn2＋、Ni2＋等。酶类药物专题知识讲座第21页（7）晶种

不易结晶蛋白质和酶，有需加入微量晶种才能结晶，（8）结晶器皿处理

结晶用器皿要充分清洗、烘干。使用前用结晶母液再冲洗一次。结晶玻璃器皿，可用硅涂料进行表面处理，以使表面光滑且不润湿。这么可降低晶核数目，形成大结晶。（四）酶分离和纯化工作注意事项1、预防酶蛋白变性2、预防辅因子流失3、预防酶被蛋白水解酶降解酶类药物专题知识讲座第22页

第三节酶类药品

一、药用酶类概述早期酶制剂主要用于治疗消化道疾病，烧伤及感染引发炎症疾病，现在我国外己广泛应用于各种疾病治疗，其制剂品种已超出700余种。（一）促进消化酶类

（二）消炎酶类（三）与纤维蛋白溶解作用相关酶类（四）抗肿瘤酶（五）与生物氧化还原电子传递相关酶

(六）其它药用酶酶类药物专题知识讲座第23页（一）胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）

胃蛋白酶广泛存在于哺乳类动物胃液中，药用胃蛋白酶系从猪、牛、羊等家畜胃粘膜中提取。1、组成（结构）、性质药用胃蛋白酶是胃液中各种蛋白水解酶混合物，含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶等，为粗制酶制剂。水溶液呈酸性，难溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。

pI为pH1.0，最适pH1.5～2.0。可溶于70％乙醇和pH420％乙醇中。胃蛋白酶能水解大多数天然蛋白质底物。酶类药物专题知识讲座第24页2、生产工艺（1）工艺路线：

胃蛋白酶原盐酸催化激活成胃蛋白酶。常见脱脂剂有乙醚、氯仿、四氯化碳。酶类药物专题知识讲座第25页（2）工艺过程：（3）胃膜素和胃蛋白酶联产工艺：向经消化、提取、脱脂、分层、浓缩及60％丙酮沉淀分离胃膜素母液中，边搅拌边加冷丙酮，至比重为0.91，即有淡黄色胃蛋白酶沉出，静放过夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。（4）结晶胃蛋白酶制备：药用胃蛋白酶原粉，溶于20％酒精中，加H2SO4调pH3.0，5℃静置20h后过滤，加硫酸镁至饱和，进行盐析。盐析物再在pH3.8～4.0乙醇中溶解，过滤，滤液用硫酸调pH至1.8～2.0，即析出针状胃蛋白酶。沉淀再溶于20%pH4乙醇中，过滤，滤液用硫酸调pH至1.8，在20℃放置，可得板状或针状结晶。酶类药物专题知识讲座第26页（二）胰蛋白酶胰蛋白酶是从牛、羊胰脏提取、结晶冻干制剂。易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有机溶剂。在pH1.8时，短时煮沸几乎不失活；在碱溶液中加热则变性沉淀，Ca2+有保护和激活作用，胰蛋白酶pI为10.1。牛胰蛋白酶在肠激酶或本身催化下，释放出6肽，变成有活性胰蛋白酶。胰蛋白酶分子量24000，由223个氨基酸残基组成。

胰蛋白酶专一作用于由碱性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所组成肽键。酶本身很轻易自溶。酶类药物专题知识讲座第27页2、生产工艺（1）工艺路线：酶类药物专题知识讲座第28页（三）糜蛋白酶（Chymotrypsin，EC3.4.4.5）胰蛋白酶可激活糜蛋白酶原成α-糜蛋白酶。2、生产工艺（1）工艺路线：（2）工艺过程：

酶原加少许胰蛋白酶，pH7.6酶类药物专题知识讲座第29页（四）尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26）尿激酶，是一个碱性蛋白酶。由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物尿中。人尿平均含量5～6国际单位／m1。1、组成（结构）性质（1）尿激酶有各种分子量形式。尿中尿胃蛋白酶原，在酸性条件下能够激活生成尿胃蛋白酶，把天然尿激酶降解成为尿激酶。（2）尿激酶是专一性很强蛋白水解酶，血纤维蛋白溶酶原是它唯一天然蛋白质底物，它作用于精氨酸-缬氨酸键使纤溶酶原转为纤溶酶。尿激酶也含有酯酶活力。酶类药物专题知识讲座第30页（3）尿激酶pI为pH8～9，主要个别在pH8.6左右。溶液状态不稳定，冻干状态可稳定数年。加入1％EDTA、人血白蛋白或明胶可预防酶表面变性作用。2、生产工艺（1）工艺路线：酶类药物专题知识讲座第31页（2）工艺过程：硅藻土吸附，0.02％氨水加0.1mol／L氯化钠洗脱。QAE-Sephadex层析柱去热原、色素。CM—C浓缩。

酶类药物专题知识讲座第32页（五）细胞色素C（CytochromeC）细胞色素C存在于自然界中一切生物细胞里，其含量与组织活动强度成正比。以哺乳动物心肌、鸟类胸肌和昆虫翼肌含量最多，肝、肾次之，皮肤和肺中最少。

1、组成（结构）、性质

细胞色素C是含铁卟啉结合蛋白质，铁卟啉环与蛋白质个别百分比为1∶1。猪心细胞色素C分子量12200。pI为pH10.2～10.8。酶类药物专题知识讲座第33页

细胞色素C对干燥、热和酸都较稳定。氧化型呈水溶液深红色，在饱和硫酸铵中可溶解。

还原型水溶液呈桃红色，溶解度较小。2、生产工艺（1）工艺路线：酶类药物专题知识讲座第34页人造沸石pH7.5吸附，蒸馏水和氯化钠溶液重复洗涤，25％硫酸铵溶液洗脱。20％三氯醋酸沉淀细胞色素C，AmberliteIRC－50（NH4＋）树脂柱吸附。酶类药物专题知识讲座第35页（六）溶菌酶（Lysozyme）

溶菌酶，又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。它广泛存在于鸟类和家禽蛋清、哺乳动物泪、唾液、血浆、尿、乳汁、白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，其中以蛋清含量最丰富。溶菌酶是一个含有杀菌作用天然抗感染物质，含有抗菌、抗病毒、抗炎症。1、组成（结构）和性质溶菌酶是一碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰氨残基及芳香族氨基酸（如色氨酸）百分比很高。酶类药物专题知识讲座第36页

溶菌酶能催化粘多糖或甲壳素中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间β-1，4糖苷键。溶菌酶是一个罕见稳定蛋白质。在pH5.5加热4h后，酶变得更活泼。低浓度Mn（10-7mol／L）在中性和碱性条件下能使酶免受热失活作用。酶类药物专题知识讲座第37页2、生产工艺（1）工艺路线酶类药物专题知识讲座第38页（七）L-天门冬酰胺酶（L-asparaginase）1、组成（结构）、性质

L-天门冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是从大肠杆菌菌体中提取分离酶类药品，用于治疗白血病。性状呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚及甲醇。最适pH8.5，最适温度37℃。

L-天门冬酰胺酶产生菌是霉菌和细菌，故可作制造酶原料。酶类药物专题知识讲座第39页2、生产工艺（1）工艺路线：酶类药物专题知识讲座第40页（八）激肽释放酶（Kallikrein）

激肽释放酶是一个蛋白酶。哺乳动物激肽释放酶有两大类：血液激肽释放酶和组织激肽释放酶。药用激肽释放酶又称血管舒缓素，主要来自颌下腺或胰腺。酶类药物专题知识讲座第41页

猪胰激肽释放酶是一个糖蛋白，含有唾液酸，在腺体中以酶原形式存在。唾液酸除去并不影响酶活性。（1）专一性激肽释放酶是一个内切蛋白水解酶，当它作用于蛋白质底物激肽原后释放出激肽。激肽释放酶只作用于天然激肽原。（2）稳定性普通说，激肽释放酶纯度越高，稳定性越差。在水溶液中不稳定，但在pH8.0水或缓冲液中，可在冷冻状态下保留相当长时间不失活。

酶类药物专题知识讲座第42页2、生产工艺（1）工艺路线：（2）工艺过程：冷丙酮33％、70％，用丙酮、乙醚脱脂、脱水。40%、60%冷丙酮分级沉淀。弱酸性阳树脂AmberliteCG－50（钠型）酶类药物专题知识讲座第43页（九）超氧化物歧化酶（SuperoxidedismutaseSOD）超氧化物歧化酶是一个主要氧自由基去除剂，作为药用酶在美国、德国、澳大利亚等国有产品，此酶属金属酶，它催化化学反应是：

因为SOD能专一去除超氧阴离子自由基（O2-）；故引发我国外生化界和医药界极大关注。当前SOD临床应用集中在本身免疫性疾病上如类风湿关节炎、红斑性狼疮、皮肌炎、肺气肿等；也用抗辐射，抗肿瘤、治疗氧中毒、心肌缺氧与缺血再灌注综合征以及一些心血管疾病。酶类药物专题知识讲座第44页1、组成（结构）、性质

(1)SOD属金属酶，其性质不但取决于蛋白质个别，还取决于活性中心金属离子存在。按金属离子种类不一样，SOD有Cu，Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD。三种酶都催化同一反应，但其性质有所不一样，其中Cu，Zn-SOD与其它两种SOD差异较大，而Mn-SOD与Fe-SOD之间差异较小。（2）SOD活性中心和构象比较特殊，金属辅基Cu和Zn与必需基团His等形成咪唑桥。（3）SOD理化性质

SOD是一个金属蛋白，所以它对热、对pH及在一些性质上表现出异常稳定性。酶类药物专题知识讲座第45页①对热稳定性

SOD对热稳定。但SOD对热稳定性与溶液离子强度相关，假如离子强度非常低，即使加热到95℃，SOD活性损失亦极少。②pH对SOD影响

SOD在pH5.3～10.5范围内其催化速度不受影响