火炬松松针多糖的超声波辅助提取工艺及其体外抗氧化活性研究

火炬松松针多糖的超声波辅助提取工艺及其体外抗氧化活性研究

火炬松（puustaedal）生长迅速，适应性强。对松毛虫有一定的抵抗力。资源充足，价格低廉，生命所需的养分和养分丰富，能够调节生命活动。这是天然绿色的保健健康食物和药物。现代药理试验研究表明松针提取物具有降血脂、抗炎、抗肿瘤、抗氧化和抗突变等诸多方面的生理活性1材料和方法1.1苯磺酸盐的合成火炬松(PinustaedaL.)松针,11月份采摘于校园,含松针多糖2.043%;无水乙醇、95%乙醇、石油醚、乙醚、丙酮、葡萄糖、浓硫酸、苯酚、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、过硫酸钾等,均为分析纯。RAT-5L玻璃反应釜,RE-52AA型旋转蒸发仪,SHZ-Ⅲ型循环真空泵,Q-350B3型高速粉碎机,FA2104V型电子天平,SB3200DTDN超声波清洗仪器,V-5600型可见分光光度计,TDL-5A型低速大容量离心机,ZD-A30普通型真空冷冻干燥机,电热恒温鼓风干燥箱。1.2松针提取多年生糖1.2.2多糖得率测定采用苯酚硫酸法制作标准曲线同样采用苯酚硫酸法测定松针多糖得率。将按1.2.1节方法提取的多糖粗品用蒸馏水复溶,将其定容于100mL容量瓶内,稀释一定倍数后准确移取1.0mL采用同上方法测其吸光度(A)。根据下列公式计算出多糖得率:式中:y—多糖得率,%;n—稀释倍数;m—松叶质量,g。1.2.3不同因素对松针多糖得率的影响采用超声波辅助热水浸提法提取松针多糖,称取3.0g预处理的松针粉末若干份,固定超声波功率为180W,在常温下超声波作用一定时间后取出,再用热水浸提,依次比较不同超声波作用时间(10、15、20、25和30min)、热水浸提时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0h)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1和35∶1)、热水浸提温度(65、70、75、80、85、90和95℃)对松针多糖得率的影响。在单因素试验基础上,利用DesignExpert8.0.5软件采用中心组合设计方法(BBD)对超声波辅助热水浸提多糖的工艺进行优化,并对模型进行多元回归拟合,以多糖得率为响应值得二元多项回归方程,优选出最佳提取工艺条件。1.3体外抗氧化活性测定将提取的粗品多糖用蒸馏水复溶,采用Sevage法除蛋白5~8次,上清液中残留的有机溶剂充分蒸发后,在蒸馏水4℃条件下透析48h,冷冻干燥得到除蛋白后多糖,测定其体外抗氧化活性。1.3.1dpph自由基dpph的测量能力参考文献式中:r1.3.2去除氨基酸自由基h的能力测试参照文献式中:r1.3.3除abt自由基abt按文献2结果与分析2.1单一因素对松针糖的得到率的影响2.1.1声波辅助提取时间对多糖得率的影响按1.2.1节操作,预处理后的松针粉30g,固定超声波功率180W,液料比20∶1,80℃浸提1h,考察超声波辅助提取时间对多糖得率的影响(见图1)。由图1(a)可知:在一定范围内,随着超声波作用时间的延长,多糖得率增加,25min时达到最大值,说明超声波对多糖的溶出作用显著,当继续延长时间多糖得率略下降,可能是因为大分子多糖超声波长时间机械剪切作用下发生断裂,稳定性下降,从而影响其得率,故超声波作用时间不宜过长,选择25min为最佳。2.1.2不同浸提时间对多糖得率影响条件同2.1.1节,超声波辅助提取25min,考察浸提时间对多糖得率的影响。如图1(b)所示:随着浸提时间的增加,多糖得率先升高后降低,在1h时达到最大。这可能是多糖已在超声波作用的过程中不断溶出并向提取液中扩散,当在热水中继续浸提时,由于多糖长时间暴露在温度比较高的环境下,使得部分多糖分解,从而导致得率明显下降,故选择1h为最佳热水浸提时间。2.1.3溶剂对多糖溶出量的影响条件同2.1.1节,考察液料比对多糖得率的影响,结果见图1(c)。由图1(c)可知:多糖得率随着液料比的增大逐渐增大,达到25∶1(mL∶g)之后基本保持不变,这可能在于溶剂用量影响有效成分的浸出,随着溶剂的增多,多糖的溶出量增大,当溶剂达到一定量时,多糖已基本溶出,其含量随着溶剂的增加不再增加。而液料比过大,后续浓缩时耗能加大,因此,从降低成本、节约能源角度考虑,选择液料比25∶1为最佳。2.1.4提取温度对松针多糖得率的影响条件同2.1.1节,考察热水浸提温度对多糖得率的影响,结果见图1(d)。从图1(d)可看出:随着提取温度的升高,松针多糖得率呈先增后降的趋势,当温度达90℃时,多糖提取得率最高;温度高于90℃,多糖得率降低,这可能是较高的温度易于细胞壁破碎、分子热运动加快而使活性多糖溶出,但温度过高造成部分多糖降解2.2反应法的优化和提取试验2.2.1响应面法优化松针多糖提取工艺根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,综合单因素试验结果,选取超声波作用时间、热水浸提时间、液料比和热水浸提温度4个因素,采用4因素3水平的响应面分析方法,对松针多糖提取工艺进行响应面分析,其具体试验方案见表1。各因素经回归拟合,得多糖得率(Y)回归方程为:2.2.2火炬松松针多糖最佳提取条件的确定由表2可知,模型的p<0.0001,差异极显著,失拟项的p值为0.8724,差异不显著,决定系数R通过响应面法分析优化,Designexpert8.0.5软件对回归方程计算,选出火炬松松针多糖最佳提取条件为:超声波作用时间27.58min、热水浸提时间1.09h、液料比27.20∶1(mL∶g)、热水浸提温度91.01℃,在此条件下模型预测松针多糖提取得率为1.703%。根据各因素影响的显著性以及响应面设计的结果,确定最佳工艺为:超声波作用时间25min、热水浸提时间1h、液料比25∶1(mL∶g)、热水浸提温度91℃,且在此条件下进行3次验证实验,结果平均得率为1.867%(提取率达91.39%),与模型预测值的误差为0.164%,实际值与理论值基本相符,说明此方法准确可靠,具有一定的实用价值。2.3松针糖的抗氧化性试验的结果2.3.1乙醇溶液的表征DPPH·是一种稳定的含氮自由基,结构中存在单电子,在乙醇溶液中显深紫色,在517nm处有特征吸收;加入抗氧化剂后,DPPH与抗氧化剂中的氢结合,颜色发生改变,吸光值也随之发生变化,从而用来评价其清除自由基能力的强弱2.3.2去除h能力FeSO2.3.3除abtABTS在反应体系中被氧化后会生成稳定的ABTS3结论1.2.1超声辅助热水浸提液松针多糖最佳工艺的确定预处理将采摘的松针除杂、干燥、粉碎,在反应釜内分别用石油醚、95%乙醇回流脱脂脱色2次,除去部分有色物质、黄酮类等杂质将预处理的松针粉采用超声波辅助热水浸提法提取,称取3.0g预处理的松针粉末若干份,固定超声波功率为180W,在常温下超声波作用一定时间后取出,再用热水浸提,依次比较不同超声波作用时间(10、15、20、25、30min)、不同热水浸提时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3h)、不同液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1和35∶1)(mL∶g,下同)、不同热水浸提温度(65、70、75、80、85、90和95℃)的条件下单因素对松针多糖得率的影响。多糖提取液抽滤、减压浓缩至原体积的1/10后,加入5倍体积95%乙醇4℃条件下沉淀5h,4000r/min离心15min,将得到的沉淀物依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤,干燥后得松针多糖粗品。为了检验回归方程的有效性,进一步确定各因素对多糖得率的影响程度,对回归模型进行了方差分析,结果见表2。3.1以石油醚和乙醇预处理后的干燥火炬松松针粉末为原料,采用超声波辅助热水浸提技术提取松针多糖,通过单因素试验和响应面设计分析对提取工艺条件进行优化,得到最佳工艺为:3.0g松针粉末,超声波功率180W,超声波作用时间25min、热水浸提时间1h、液料比25∶1(mg∶L)、热水浸提温度91℃,在此条件下3次验证实验后多糖平均得率可达1.867%,提取率达91.39%,并建立了合理可靠的二次多项式模型,该模型p<0.0001,即