蛋白质相互作用多种方法

蛋白质互相作用多种办法第1页Proteininteraction：twoormoreproteins(sameordifferent)interactorformcomplex第2页人类蛋白质组相用

有某些蛋白质能够以单体形式发挥作用，不过大部分蛋白质都是和伴侣分子或是与其他蛋白质一起发挥作用。蛋白质有关知识及研究蛋白质互相作用必要性第3页蛋白质互相作用：本身具有生物学意义：这样互相作用在生物体中是起什么作用发展技术：利用这样互相作用发明出某些人为作用第4页利用生物信息学办法由繁入简试验分析办法由简入繁第5页整体系统部分单体第6页酵母蛋白质互相作用联系图人蛋白质互相作用联系图第7页研究蛋白质互相作用目标是发觉并明确其互相作用生物学意义蛋白质互相作用是一种表象，通过表象分析规律，是研究蛋白质互相作用关键“种瓜得瓜，种豆得豆”是一种表象，反应了遗传这样一种本质现象可研究对象合适研究办法第8页研究蛋白质互相作用需要微观和宏观结合象与象一部分第9页

研究蛋白质互相作用意义1、蛋白质间互相作用是细胞生命活动基础。2、基因只是决定蛋白质，而蛋白质才是发挥作用主体。蛋白质互相作用是发挥其功能主要活动。第10页稳定互相作用形成蛋白质复合体

（proteincomplex）瞬时互相作用（enzyme-substrate）生物学效应稳定互相作用与瞬间互相作用共同组成蛋白质互相作用内涵。第11页研究蛋白质互相作用是为了研究对应生物学功能确定研究目标寻找互相作用建立互相作用网络和功能体系第12页从蛋白质互相作用到生物学功能。利用蛋白质直接互相作用，发觉互相作用蛋白质，再分析这些作用生物学意义。容易犯错误：研究一大堆蛋白互相作用，却不懂得这些互相作用有什么生物学意义。从生物学功能到蛋白质互相作用。通过变化生物学现象，分析蛋白质间遗传互相作用，深入研究有关蛋白质互相作用。容易犯错误：找到了平行变化不有关蛋白质。第13页免疫共沉淀噬菌体展示技术酵母双杂交技术基因外抑制子合成致死筛选分子生物学办法Pulldown试验遗传学办法蛋白质互相作用研究办法生物物理学办法串联亲和纯化第14页

免疫共沉淀

（co-immunoprecipitation，CO-IP）

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在许多蛋白质－蛋白质间互相作用被保存了下来。假如用蛋白质X抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合蛋白质Y也也许沉淀下来。蛋白质Y沉淀是基于与蛋白质X物理性互相作用，称为免疫共沉淀。

第15页Westernblot：变性抗原，主要用于检测蛋白质存在是否。免疫共沉淀：非变性抗原，用于判定不一样蛋白质间互相作用。多采取非离子变性剂（NP40或TritonX-100)第16页免疫共沉淀检测蛋白质原理和常见问题YABAYBY非特异性第17页试验过程第18页试验过程（1）加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min,细胞裂解液于4°C，最大转速离心30min后取上清；（2）取少许裂解液以备Westernblot分析，剩下裂解液加1μg对应抗体加入到细胞裂解液，4°C迟缓摇晃孵育过夜；（3）取10μlproteinA琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心3min；（4）将预处理过10μlproteinA琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜细胞裂解液中4°C迟缓摇晃孵育2-4h，使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连；（5）免疫沉淀反应后，在4°C以3,000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；（6）SDS,Westernblotting或质谱仪分析。第19页实验关键1、试验最需要注意点就是抗体性质。抗体不一样和抗原结合能力也不一样，尤其是多抗特异性是问题。2、为避免蛋白分解、修饰，溶解抗原缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行试验。3、考虑抗体/缓冲液百分比。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残余在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。第20页主要用于：两种感爱好蛋白质是否在体内存在互相作用；也用于判定一种特定蛋白质未知互相作用蛋白。

注意：1要求在一系列清洗过程中保持蛋白质复合体不变。由于出现假阳性概率比较高。

2设置对照：在对照组中使用对照抗体，以缺失目标蛋白细胞系作为阴性对照等等。第21页Westernblot1、电转移效率2、PVDF膜充足浸润3、转移液中有太多SDS4、膜损坏5、转移时胶和膜没有完全接触6、抗体问题7、抗体浓度太高或太低8、还原性物质存在9、封闭不充足第22页长处：1、互相作用蛋白质都是经翻译后修饰，处于天然状态；2、蛋白互相作用是在自然状态下进行，能够避免人为影响；3、能够分离得到天然状态互相作用蛋白复合物。第23页缺陷：1、也许检测不到低亲和力和瞬间蛋白质－蛋白质互相作用；2、两种蛋白质结合也许不是直接结合，而也许有第三者在中间起桥梁作用；3、如用westernblot检查，必须在试验前预测目标蛋白是什么，以选择最后检测抗体，若预测不正确，试验就得不到成果，办法本身具有冒险性，敏捷度不如亲和色谱高。第24页

GSTpull-down技术

1988年Smith等利用GST融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白,从此GST融合蛋白在研究蛋白质互相作用领域得到极大推广(His也常用)。此办法是一种行之有效验证酵母双杂交系统体外试验技术。还应当在体内用单独办法，如免疫共沉淀加以证明。

第25页靶蛋白X基因亚克隆到带有GST基因原核体现载体中，并在细菌中体现GST融合蛋白（GST-X）把GST融合蛋白(探针、诱饵蛋白)挂到带有GST底物Sepharosebeads上，然后把另一种含目标蛋白质（捕捉蛋白）溶液加入其中。由于谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白，如发生互相作用则形成复合物：GST-X-Y，沉淀搜集下来，洗脱非特异结合蛋白后采取SDS判定与诱饵蛋白质互相作用蛋白质。原理第26页GST-Pulldown

Assay右：对照，中间翻转混合时发生互相作用，胶上只与GST融合蛋白结合而不与GST结合特异性条带表达新互相作用蛋白。第27页GSTpulldownGSTFusionProteinPurificationbindingwashelution第28页GSTpulldownGSTfusionprotein不够纯，用作bait会产生太多非特异性蛋白质污染。第29页检测GST融合蛋白与靶蛋白互相作用：1、放射性标识融合蛋白：迅速简单易行2、抗GST抗体检测3、生物素标识融合蛋白：没有放射性，但也许对探针蛋白和其他蛋白互相作用有影响。第30页应用：一确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间新互相作用；一是判定两个已知蛋白质之间是否存在互相作用。第31页特点：比较简便，假如用抗GST抗体检测或生物素标识融合蛋白避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质互相作用研究中有很广泛应用。融合蛋白具有高通量性、高选择性特点，由于融合蛋白多样性以及体现系统多样性(如细菌、果蝇、哺乳动物)，该办法能够研究蛋白质在复杂体系中互相作用。

注意：该办法成功应用取决于是否能够得到足够多，并且保持蛋白质活性重组融合蛋白，且无过度降解（探针蛋白变成不一样降解产物混合物）和不溶，以及如何避免内源性诱饵蛋白干扰。第32页串联亲和纯化（TAP）近年来质谱技术发展迅速，其功能强大且敏捷度高，常用来判定互相作用蛋白质复合体或复合体亚基，但一般难以取得足够量纯化蛋白质复合体，成为质谱在这方面应用一种限速步骤。1999年Rigaut（德国）等人共同提出了一套分离复合蛋白新办法—串联亲和纯化(Tandemaffinitypurification，TAP)，兼具标准亲和纯化（能够得到高纯度地拷贝数蛋白质复合体）和免疫共沉淀（用于特异性标识蛋白与亲和柱之间互相作用）两种生化办法长处，为蛋白质复合体分离判定提供了一条新途径。

第33页适用：研究蛋白质复合体中多种蛋白质间互相作用，尤其适用于研究蛋白质在生理条件下互相作用第34页首先通过基因工程给被分离纯化蛋白一端加一种TAP标签，该标签由IgG结合构造域(ProtA)及一种钙调蛋白结合多肽(CBP)组成，构造域与多肽之间由一种TEV蛋白酶切位点隔开。原理办法

第35页第36页

1、基因重组将细胞内源性目标蛋白基因置换为带有TAP标签基因，温和裂解细胞，获取细胞抽提物。

2、将抽提物加入IgG亲和柱，TAP标签ProtA端会与IgG形成强结合，在用洗脱液洗脱掉大部分非特异性结合物和杂蛋白。

试验流程第37页3、具有TEV蛋白酶洗脱夜将蛋白质复合体切割下来。在钙离子参与下，被切割下来带有CBP蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合，充足洗脱，就能够深入清除非特异作用蛋白质杂质，最后纯化出高纯度目标蛋白复合体。4、通过串联亲和纯化目标蛋白，通过SDS或者双向电泳分离之后，找出与目标蛋白互相作用蛋白质，采取质谱分析办法对其进行分析判定。第38页Mammalian

Tap-tag-LC-MS/MS

method第39页

TAP长处加工和修饰过蛋白能够作诱饵，互相作用发生在天然环境和细胞部位，一次操作能够分离和分析多组分复合物，得到广泛应用，由于TAP标签高度特异性以及采取两步洗脱纯化法，在纯化过程中不需要强烈冲洗，因此能够更加好地保持较不稳定蛋白质复合物，并且非特异蛋白量也会很低，这是一步纯化法所不能比拟。克服了双杂交筛选步骤复杂、假阳性成果较多、难于量化、不能满足大规模蛋白质组研究需要缺陷。第40页TAP缺陷更倾向于高丰度和稳定互相作用，许多低亲和力、瞬时和依赖特殊细胞环境互相作用也许检测不到。另外，TAP必须采取能产生体现TAP标签蛋白，这种标签蛋白体现最佳接近生理水平，因此最佳将带标签基因用天然启动子体现。但在哺乳动物细胞中，天然启动子体现标签蛋白是非常困难，其体现水平不一样于无标签内源蛋白，由非生理水平诱饵蛋白而产生假阳性。第41页亲和纯化（affinitypurification

）纯化：

抗体

Epitope-tag：flag,myc,HA,V5,GST…

核酸Pull-downImmunoprecipitationTAP(TandemAffinityPurification)

第42页酵母双杂交（Yeasttwo-hybrid

）

1989年Field等发明了酵母双杂交系统。该系统利用了酵母生长转录因子GAL4具有两个构造域,DNA结合域(DNAbindingdomain,BD)及转录激活域(activationdomain,AD),将已知基因(诱饵基因)和靶基因或具有靶基因cDNA分别构建在含BD及AD质粒载体上,将这两种质粒共同转化酵母感受态细胞,若BD结合诱饵蛋白能够与AD结合靶蛋白或文库中某些cDNA编码蛋白互相作用、彼此间结合时,则会造成位于侧翼BD与AD在空间上接近,展现GAL4转录因子完全活性,启动下游报告基因如His及LacZ等基因体现,从而在特定缺陷培养基上生长。一、酵母双杂交系统基本原理第43页典型真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都具有二个不一样构造域:DNA结合构造域(DNA-bindingdomain)和转录激活构造域(transcription-activatingdomain)。前者可识别DNA上特异17bp长序列（UAS），并使转录激活构造域定位于所调整基因上游，转录激活构造域可同转录复合体其他成份作用，启动它所调整基因转录。第44页第45页His,β-gal第46页BD和AD功能上互相独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在一起才具有完整转录因子活性第47页据此可将两个待测蛋白（X和Y）分别与这两个构造域建成融合蛋白（BD-X和AD-Y），并共体现于同一种酵母细胞内，假如两个待测蛋白间能互相作用，就会通过待测蛋白桥梁作用使AD与BD形成一种完整转录激活因子，并激活对应报告基因体现。通过对报告基因检测就可很容易懂得待测分子间是否发生了互相作用。深入用已知蛋白X作为诱饵，分离取得与之互相作用蛋白质Y及其编码序列。第48页His,β-gal第49页二、酵母双杂交系统组成与BD融合蛋白体现载体诱饵蛋白baitprotein与AD融合蛋白体现载体靶蛋白preyprotein带有多种报告基因宿主菌株

HIS3、URA3、LacZ和LEU2等第50页报告基因LacZreporter-Blue/WhiteScreeningHIS3reporter-ScreenonHis+media(usuallyneedtoadd3ATtoincreaseselectivity)LEU2reporter-ScreenonLeu+mediaADE2reporter-ScreenonAde+mediaURA3reporter-ScreenonUra+media(candonegativeselectionbyaddingFOA)第51页第52页

X-β-半乳糖苷酶蓝白斑显色分析举例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-AD第53页Yeasttwo-hybrid（酵母双杂交）应用

发觉新互相作用蛋白质

判定和分析已有蛋白质间互相作用

确定蛋白质间互相作用功能基团第54页lacZUASDBADlacZUASADDBlacZlacZUASADYDBXlacZ第55页发觉新互相作用蛋白质BDB-PrMarker1AD基因库Marker2lacZUASADYlacZDBB-prBDB-PrMarker1AD基因库Marker2lacZUASADlacZDBB-prBDB-PrMarker1YAD基因库Marker2第56页文库筛选步骤1、将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白DNA结合域融合构建诱饵质粒。2、将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子酵母细胞株中，选择被转化酵母。3、再将文库质粒转化到酵母中。4、通过报告基因功能筛选互相作用蛋白。第57页确定蛋白质间互相作用功能基团ProteinA1234BDB-PrMarker1AD1Marker2AD2Marker2AD3AD3白兰白白第58页判定和分析已有蛋白质间互相作用BDB-PrMarker1ADA-PrMarker2兰：互相作用白：不互相作用第59页序列分析

从酵母中分离质粒然后转化E.coli从大肠杆菌中提取质粒并测序在数据库中比对所测定序列与已知蛋白同源性第60页酵母双杂交测序成果酵母双杂交得到阳性克隆子质粒通过DNA测序，由NCBI数据库BLAST检索cDNA编码蛋白质举例第61页测序成果查询过程cDNA序列NCBIBLASTNucleotidemegablastsearchformatresults第62页Blast举例第63页Results举例第64页长处

1、迅速取得互相作用蛋白基因2、只需单一步骤质粒构建3、检测在真核活细胞内进行,在一定程度上

代表细胞内真实情况。4、作用信号是在融合基因体现后,在细胞内重建转录因子作用而给出,省去了纯化蛋白质繁琐步骤第65页5、检测成果能够是基因体现产物积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间薄弱或临时互相作用。6、酵母双杂交系统可采取不一样组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不一样亚细胞部位及功能蛋白。7、通过mRNA产生多种稳定酶使信号放大。同步,酵母表型,X—Gal及HIS3蛋白体现等检测办法均很敏感第66页不足1、双杂交系统分析蛋白间互