基因工程的基本操作程序第1课时 高二下学期生物人教版选择性必修3

基因工程的基本操作程序（一）棉铃虫棉铃虫（死亡）00培育抗虫棉的简要过程苏云金芽孢杆菌提取普通棉花(不抗虫)棉花细胞与载体DNA拼接，导入棉花植株(抗虫)(含抗虫基因)表达抗虫基因抗虫基因（BT毒蛋白基因）农杆菌00基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定01目的基因的筛选与获取在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据需求的不同，目的基因也不同，主要指编码蛋白质的基因，如遇生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。目的基因01目的基因的筛选与获取知识回顾必修二：请从DNA水平上给基因下一个定义，要求既能反映基因与DNA的关系，又能体现基因的作用。基因通常是有遗传效应的DNA片段但一段DNA片段不一定是基因--ATGCATGCATCGATGCTAGCGATCGCTAAGCACAG-----TACGTACGTAGCTACGATCGCTAGCGATTCGTGTC---基因1基因2非基因片段启动子内含子内含子终止子外显子外显子真核生物基因的结构01目的基因的筛选与获取筛选Bt基因作为转基因抗虫棉的目的基因的原因用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息对Bt基因的表达产物--对Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。（教材P76）01目的基因的筛选与获取去哪里找？NCBIGeneBankBLAST01目的基因的筛选与获取如何获得？复制复制复制复制复制聚合酶链式反应（PCR）01目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应（PCR）根据DNA半保留复制的原理，在体外（PCR扩增仪）提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。01目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应（PCR）解旋酶DNA聚合酶母链(模板链)子链(新合成的链)四种脱氧核苷酸3’5’3’5’5’体外用高温代替！引物解旋酶和高温都能使DNA的氢键断裂，使DNA的两条链解旋。01目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应（PCR）▲引物:在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始合成子链，必须由引物提供3′端之后才能开始连接脱氧核苷酸。是能与DNA母链互补配对的一小段短单链核酸序列.RNA单链、DNA单链由于DNA双链是反相平行的，所以需要两种引物。引物启动DNA的复制01目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应（PCR）☆说明：DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA有羟基(-OH)的一端称为3’端，而没有羟基的一端称为5’端。DNA的合成方向总是从5’

端到3’端延伸。01目的基因的筛选与获取DNA模板Step1：加热至90℃以上使双链分开Step2:冷却至50℃左右使引物与DNA结合引物Step3:DNA合成+DNA聚合酶+dATP+dGTP+dCTP+dTTP第一轮的产物①变性90℃以上②复性③延伸冷却加热50℃左右引物模板结合72℃左右DNA从5’端到3’端延伸。72℃时，01目的基因的筛选与获取第一轮产物①变性②复性③延伸循环01目的基因的筛选与获取思考1复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。思考2用PCR可以扩增mRNA吗？不能！由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增单链RNA逆转录酶杂交双链DNA链RNA链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNAPCR扩增01目的基因的筛选与获取思考3获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？第二轮产物PCR扩增三次才能得到目的基因如何对产物进行检测鉴定？01目的基因的筛选与获取思考4如何对产物进行检测鉴定？琼脂糖凝胶电泳凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来。

DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。02基因表达载体的构建思考5获得目的基因之后直接转入受体吗？不是游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。解决办法？思考5质粒细菌染色体植物染色体细胞核表达载体02基因表达载体的构建基因表达载体的作用：①让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；②使目的基因能够表达和发挥作用。☆基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。启动子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程。终止子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，终止转录。02基因