脑科学研究的方法

多学科综合神经科学神经解剖学神经生理学神经生物化学心理学………..第一章脑科学研究办法和伎俩第1页多层次研究认知神经科学计算神经科学临床神经科学系统和行为神经科学发生神经科学细胞神经科学分子神经科学神经科学第2页研究水平整体行为水平：行为学，躯体感觉，视听觉，痛觉等

细胞水平：神经细胞培养、生物电活动检测、通路示踪、细胞染色、免疫化学、凋亡检测分子水平试验：离子通道、受体、酶、遗传物质等第3页一、形态学办法二、生理学办法三、电生理学办法四、生物化学办法五、分子生物学办法六、脑成像（Brainimaging）技术第4页一、形态学办法常规染色和特殊染色束（通）路追踪法

荧光组织化学法原位杂交法受体定位法神经系功能活动形态定位法

第5页1.常用一般染色办法TTC染色HE锇酸染色氯化金浸染Cajal银浸染色尼氏染色第6页HE（苏木素－伊红）第7页锇酸染色是神经科学研究一种常用而普遍办法，它本来是用来固定脂质，由于髓鞘主要成份是脂质，因此用于有髓神经纤维染色

锇酸染色第8页氯化金浸染运动终板Ach荧光染色氯化金浸染第9页Cajal银浸染色第10页尼氏染色多种办法，HE、甲苯胺蓝，焦油紫，硫堇，天青，派洛宁，中性红以及棓花青等碱性苯胺染料均能够使尼氏体着色第11页2、束（通）路追踪法：研究神经元之间联系

第12页束路追踪原理：轴浆运输示踪物质：HRP，荧光染料，多种标识物标识葡萄糖，放射性核素标识氨基酸等。观测：根据示踪物质不一样，采取组织显色、荧光显微镜或放射自显影等办法。第13页轴浆运输法—利用神经元轴浆运输现象追踪法.

追踪剂：辣根过氧化物酶(horseradishperoxoidase,HRP)、荧光染料包括核黄(nuclearyellow)、固蓝(fastblue)及荧光金(fluorogold)、植物凝集素如麦芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)和菜豆凝集素(phaseolusvulgarisagglutinin)、细菌毒素如霍乱毒素、病毒如活神经病毒

(胞疹病毒和弹状病毒）

第14页l

变性法：利用神经元包体受损或神经轴突离断后远侧轴突变性，或轴突切断后细胞反应，来研究纤维联系。*物理性办法：刀切割、电凝、电离破坏、超声破坏等。*化学性破坏：兴奋性氨基酸（海人酸和鹅高蕈氨酸）、单胺类神经毒（６－羟多巴胺、６－羟多巴、双羟色胺）

第15页神经元质膜荧光染料法：

用羰花青（carbocynine）荧光染料，能够染出神经细胞质膜，并能够在活体或固定标本上追踪纤维联系。

第16页最新研究进展：

华人学者绘制小鼠大脑神经网络图不一样大脑区域必须互相沟通才能控制复杂思想和行为，但目前对于这些区域组织成为广阔神经元网络机制却相对知之甚少。2023年2月27日《细胞》（Cell）杂志上一项新研究中，南加州大学董宏伟等研究人员采取神经元示踪技术绘制出了一张小鼠全脑图谱，揭示了大脑皮质中数百条神经元通路。在显微镜下将可见荧光分子注入到整个小鼠大脑皮质不一样区域，这些小分子沿着“细胞高速马路”运输，标识了大约600个神经元通路。研究人员采取高辨别率显微镜扫描了这些大脑区域，构建出了皮质连接图像数据库。第17页当研究人员分析这些连接时，他们发觉大脑皮质是一种高度组织化网络，由八个子网络组成，它们协调活动反应动物情感和感觉。并且，子网络之间以一种非常特殊方式来共享这一信息。“这些研究发觉挑战了流行假说：大脑皮质是一种单一网络，在这一网络中所有一切都密集连接在一起。”接下来，研究人员可将来自这一主要哺乳动物模型系统解剖数据与大量现有分子遗传数据合并来鉴别神经细胞基本类型。“确定全脑构造组织将是朝着揭示脑功能以及在神经系统疾病中功能障碍构造基础迈出基本且令人兴奋一步，”董宏伟说。第18页我们真会永远不老吗？——从“科学狂人”抗衰老研究说起JohnCraigVenter身上从不缺乏话题。从单枪匹马与人类基因组计划展开竞争、时代杂志将他与人类基因组计划代表FrancisCollins同步选为封面人物，到宣布制造出首个能够自我复制活细胞“Synthia”，轰动了整个学术界，Venter每一种举动，在学术界都会引发波澜。前阵子，他又宣称将组建新公司HLI，组建史上最大基因组数据库，结合基因组学、生物信息学及干细胞疗法，致力于抗衰老研究，并延长人类寿命。第19页【为何我们会追求不老和长寿】对于不老和长寿摸索，恐怕是除了“我们是谁”“我们从哪儿来”之外，人们思考第三个问题了——“我们能否始终存在下去”。【对衰老和长寿基因研究】有一种规律，很多问题，假如解释不了，就说它是由于基因决定，多半错不到哪里去。也因此，生物学家、医学家们纷纷开始将遗传学和分子生物学结合，从基因角度开始对长寿和衰老问题摸索。第20页目前基因方面研究主要有两个方向，长寿基因和衰老基因。这里说并不是单一基因，而是与长寿和衰老有关多种基因，它们之间互相作用带来了不老和长寿成果。衰老体现为染色体端粒长度变化、DNA损伤、甲基化等，衰老终点就是死亡，这些原因也是影响长寿原因。有科学家以为，端粒（细胞核两端特殊DNA片段）长度决定生物寿命，端粒缩短会造成细胞分裂停顿和死亡来临。发觉端粒三位科学家取得了2023年诺贝尔生理学或医学奖。目前“长寿基因”和“衰老基因”还不能完全确定，但有学者以为，消除自由基某些酶类基因、与细胞生长调控有关某些基因与长寿和衰老有关。对于长寿和衰老基因，科学上还需要继续发觉更多有关基因，理清那些造成衰老、影响长寿基因群及其之间联系，才能在理解基因组基础上，处理衰老、长寿问题。第21页【其他长寿和抗衰老措施】除了基因研究外，尚有抗衰老制剂研究。褪黑素与微量元素是被以为有抗衰老作用物质。褪黑素自由基清除能力在众多自由基清除剂中体现尤其突出，而微量元素摄入不协调，将造成衰老。尚有一种说法，节食能够延长寿命。这背后生物学原理是：生长激素和胰岛素信号途径在起作用。科学家通过对猴子、酵母菌、果蝇等动物研究中验证了减少卡路里摄入能够延长寿命理论。另某些科学家提出引发机体衰老和疾病是自由基增多，这也是现实生活中那些宣称“清除自由基，恢复年轻态”保健品所依赖理论基础。这些保健品疗效有限，请不要容易尝试。除了遗传原因之外，人生活环境、人心理情况等多方面原因都会影响到寿命。保持愉悦心情，健康生活方式，良好饮食习惯，这样虽然躯体不可避免老化，但还是有年轻心态，总好过长寿但不快乐，年轻外表下，却住着一种老灵魂。第22页对于长寿基因及衰老基因发掘，也有不赞同声音。他们以为这违反了伦理道德，假使我们不老不死，那么进化要领“生存和繁殖”，也会越来越少被考虑，我们将剥夺后裔生存机会。技术进步带来潜在社会问题，尚有待深入去处理。就目前研究情况来看，长寿不意味着不会永生，科学帮助下，人们有机会将有限生命拉长，将有限生命过得更有质量，实现不老不病愿望。此时又想到了Venter先生，据悉，Venter曾作为美国海军医疗队医院参与越战，战场残酷使他结识到生命和时间珍贵，他以为人生每一分钟都应当有所创新。撇开进化需要不谈，试想有一天，我们不再会变老，没有疾病，寿命很长，我们是否还会像出生即知将死时候那样，爱惜生命中每一天，而努力奋斗呢。第23页3、荧光组织化学法

用特异性抗体显示神经组织化学成份办法。第24页基本过程有：固定、制片、反应等三步。

l

免疫组织化学反应：有直接法和间接法

l双重免疫组织化学染色：主要是为了研究两种物质在同一细胞或突起内共存现象，或含两种不一样化学物质互相关系。第25页免疫组化根据二抗标识不一样（荧光素、酶、铁蛋白、胶体金或银标识），免疫组化包括免疫荧光、免疫酶组织化学、免疫金银及铁标识技术第26页核酸分子杂交技术，检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质基因体现。基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配正确特点，应用已知碱基序列并具有标识物RNA或DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，通过标识物显示，在光镜或电镜下观测目标mRNA或DNA存在与定位。4、原位杂交法

第27页此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：①利用大肝杆菌重组带有目标基因质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA)；②应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录取得反义RNA探针(cDNA)；③根据待测核酸核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。cRNA和cDNA常用标识物有32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。第28页组织学应用原位杂交术主要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上定位与体现；后者是研究细胞某种蛋白质基因转录物mRNA在胞质内定位与体现。核酸分子杂交术有很高敏感性和特异性，它是免疫细胞化学基础上，深入从分子水平探讨细胞功能体现及其调整机制，已成为目前神经生物学研究主要伎俩。第29页5、受体定位法：研究受体在神经系统内定位

配体法：主要在组织切片上进行，利用标识配体和受体结合以示踪其部位

免疫组织化学法：用针对受体抗体第30页6、神经系功能活动形态定位法

脱氧葡萄糖法：原理是：神经元活动时其能量代谢增加，而其能量代谢主要依赖葡萄糖。在脑内存在脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2DG)时，神经元可不加区分地将2DG与葡萄糖一起摄入细胞内，二者都是己糖激酶底物。但2DG在其被磷酸化成2DG-6-PO4后，不能被磷酸己糖异构酶深入转化为果糖-6-PO4，不能继续在糖酵解循环中代谢。如在2DG上标以同位素。神经元内同位素堆积程度反应了神经元活动程度。

第31页c-fos(Fos)法：

c-fos是一种原癌基因，属于即刻－早期基因类(immediate-earlygene).很多刺激条件可通过第二信使引发神经元c-fos体现增加，形成fosmRNA。由fosmRNA翻译成Fos蛋白，立即转位至细胞核内，与另一即刻早基因c-jun所产生蛋白Jun组成二聚体（第三信使），调整其靶基因体现，引发一系列细胞反应。

第32页细胞色素氧化酶法：

神经元线粒体内细胞色素氧化酶是提供神经元能量主要酶，细胞色素氧化酶水平与神经元能量需求密切有关，一般反应慢性刺激成果。

第33页二、生理学办法

损毁法

刺激法周身给药法脑室注射法脑组织培养亚细胞分析神经递质释放量测定

神经递质功能测定

行为学办法

最常用有两种：神经行为学、电生理学第34页1、神经递质释放量测定（在体invivo和离体invitro)推挽灌流法：

在体研究中枢核团递质释放有用办法。通过推挽灌流套管，使灌流液直接灌流脑组织，从流出液中分析神经递质变化。

第35页第36页脑透析术(braindialysis)：在特定脑区内，植入透析探头，用生理溶液灌流时，细胞外液中神经递质可顺浓度递度从透析管扩散至灌流液中，搜集和测定灌流液中神经递质含量，就能监测该递质变化过程。脑透析术装置包括探头、导管、微量灌流泵、样品搜集器和定量分析仪。

第37页第38页第39页

抗体微探针法：是在玻璃微电极上涂上一层神经肽抗体，用于在中枢神经系统内定位神经肽释放。硼硅玻璃与r－氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri-etriethoxysilane）反应后在玻璃表面形成一层带有游离氨基硅氧烷(siloxane)多聚体微粒。该玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)处理，使戊二醛与蛋白质A以共价键方式偶联，蛋白质A再与神经肽抗体结合，制成抗体微探针第40页脑片灌流法

突触体灌流法第41页2、神经递质功能测定

微电泳：能将微量神经递质导入神经元附近，观测其作用。抗体微量注射：特异性抗体注射在某些部位，可中和神经末梢释放出而进入突触间隙神经肽，避免其与受体结合。因此，抗体微量注射所引发功能变化可解释为消除该神经肽生理效应成果。生物检测（Bioassay）:典型办法.如用水蛭背最长肌测定ACh作用，敏捷度达10-10g.第42页3、行为学办法

l

典型条件反射：代表了刺激与强化关系。l操作式条件反射：是通过动物本身某个特定操作动作而取得食物或回避有害刺激反应活动。

第43页Behavioralneuroscienceisthestudyoftheneuralmechanismsmediatingnormalandabnormalbehaviors.自主活动动物焦虑检测：实行焦虑原因，如饮食或饮水剥夺，检测反应，能够用于药品筛选。性和生殖行为：进化，神经内分泌作用机制学习记忆摄食行为惊慌反射社会行为

……..第44页自主活动箱试验动物自主活动标志着动物中枢神经系统兴奋状态，当中枢神经系统兴奋时，自主活动加强，抑制时则自主活动减少。观测动物自主活动是评价中枢神经兴奋状态一项主要指标。多种作用于中枢神经系统药品都可影响动物自主活动，因而自主活动统计是研究中枢神经系统药品主要办法，并且在新药研究中，观测药品对动物自主活动影响也是评价药品是否影响中枢神经系统主要办法．第45页自主活动箱试验主要技术指标：运动次数第46页洞板试验检测小鼠自动活动，可用于新药，一般药理，神经系统研究和中枢兴奋性，抑制性研究。主要技术指标：小鼠探洞次数。第47页学习记忆行为学检测

学习记忆功能包括空间学习记忆功能和非空间学习记忆功能。伴随对大脑学习记忆机制研究不停深入以及寻找有效防治认知障碍类疾病办法需要，使得动物行为学试验成为研究脑高级功能及其他神经科学不可缺乏主要伎俩，客观精确地评价试验动物学习记忆水平已成为神经生物学和神经药理学中非常主要研究内容。第48页学习记忆功能检测常用试验程序空间学习记忆任务非空间学习记忆任务Morris水迷宫T迷宫6或8臂放射状水迷宫LashleyⅢ

迷宫放射状迷宫（8臂、12臂）H-W迷宫Y迷宫新奇物体认知环形平台嗅觉辨别T迷宫穿梭箱试验跳台试验第49页Morris迷宫1981年，英国心理学家Morris初次设计应用了这种水迷宫及其程序。目标是帮助大脑学习记忆机制研究。起初试验动物主要为大鼠，此后该迷宫系统成为评定啮齿类动物空间学习和记忆能力典型程序，广泛利用于神经生物学、药学等领域基础和应用研究中。第50页Morris水迷宫应用:判断动物空间学习记忆能力组成:观测指标:潜伏期，途径，不一样象限停留时间和长度，搜索策略等第51页Morris水迷宫第52页第53页Morris水迷宫原理水是啮齿类动物非常厌恶刺激或环境。鼠在水池中就会急于寻找逃路。它们习性为在水池四周寻找出口逃避，但深而光滑垂直池壁妨碍了这种企图。试验中设置水下平台（用于小鼠常为水面下1cm）可提供鼠栖身场所。但在巨大水面上，强迫游泳动物不能看见平台。它们若要迅速找到平台而避免淹没就必须利用环境中线索进行定位。从而检测了鼠记住环境中线索及其与平台位置关系而对平台进行定位能力（学习记忆能力）。第54页Morris水迷宫长处由于对年纪有关性空间记忆损害有可靠敏感性，Morris水迷宫是判断老年小鼠空间学习记忆能力尤其有用工具。驱动动物逃避是水刺激，而不需要食物和水剥夺。因此，避免了剥夺食物和水后给试验动物带来新陈代谢方面问题。动物无须接收电休克，这在那些食欲促进任务（appetitivetasks）如辐射状迷宫和T迷宫中是常规要求。能提供较多试验参数，系统全面地考查试验动物空间认知加工过程，客观地反应其认知水平。将试验动物学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，减少它们对学习记忆过程检测干扰。既能够检测空间参照记忆又能够检测空间工作记忆。在用固定平台测试小鼠空间参照记忆后再将平台位置改为不固定，就可检测它们工作记忆能力。显然，寻找不固定平台认知过程要复杂某些，需要动物对时间和空间上分离信息加以整合和判断。操作简便，数据误差较小。第55页Morris水迷宫不足之处由于需要监视系统及分析软件，只有少数装备较好试验室能够实行。试验程序设计需要考虑原因较多，同步需要试验者具有一定神经生理学、认知生理学和数理统计方面知识，给试验开展和成果解释带来困难，同步也限制了该迷宫深入广泛应用。由于体力消耗太大，体温也丧失过多，年老体弱鼠完成任务较困难。并非所有鼠株都适合于Morris迷宫测试，如BALB/c不能学会该任务（成绩并不随天数增加而进步），129/SvJ学习成绩也偏差。个体间成绩差异巨大。某些株，如129/SvJ株小鼠由于有年纪有关性视路病变(visualpathology)，在衰老时完成以视觉为基础学习记忆任务时就会出现困难。在C57BL/6株，由于严重秃头症（alopecia）存在，也许使某些小鼠产生抑郁，加上溃疡性皮炎，最后也许影响小鼠游泳能力而影响试验成绩。对轻微学习记忆能力减退，该迷宫程序也许不敏感。所占试验场地过大。第56页LashleyIII水迷宫第57页LashleyIII水迷宫

是一种相对复杂迷宫。它具有动物必须学会避免盲端（culs-de-sac）和动物必须做出正确左或右拐弯T选择。试验进行5天，每天进行2次测试（上下午各1次）。每天2次测试被平均。指标包括：学习指数（正确进入数/进入总数）、游向目标时盲端进入数及T选择错误数、向后进入总数、逃生所用时间等。第58页八臂放射状旱迷宫八臂放射状旱迷宫，是Olten和Samnelson在1976年设计，做为一种评定大鼠空间学习记忆办法。它能够同步评定试验动物工作记忆和参照记忆。原理利用食物作为鼓励措施而达到目标地，饥饿动物需要实行尤其搜索次序或利用最短时间或最小错误来谋求奖赏。第59页八臂放射状旱迷宫装置八臂放射状旱迷宫是由从中央平台伸出8个相等臂呈放射状排列组成，8臂中有4臂末端放有食物，在同一天整个试验过程中哪些臂中具有食物保持固定不变，但每天之间都有变化。迷宫周围有若干空间线索。试验前大鼠需被剥夺食物和水，试验开始时，大鼠被放在中央平台处后去寻找食物。在试验中大鼠需记住哪些臂已被摸索过，食物已被摄取，以避免再次进入，从而在最短时间内取得最大量食物。同步，在每天试验结束后，大鼠还必须放弃当天记忆信息，以准备适应第二天试验。第60页八臂放射状旱迷宫应用评定动物工作记忆和参照记忆

工作记忆是指利用一种仅仅在短时间内保存信息，或称为试验特定信息（trial-specificinformation）而取得记忆，它是对试验中可变事物记忆能力。

参照记忆是对连续存在信息，或称为任务特定信息（task-specificinformation）记忆，它是对试验中不变事物记忆能力。第61页八臂放射状旱迷宫观测指标时间测定和错误积分存在问题长处：同步评定试验动物工作记忆和参照记忆不足：气味影响。包括食物气味、其他动物气味以及动物本身气味。试验动物被限制食物和水，由此会带来影响。并且不一样食物奖赏也可产生显著影响；另外，动物种属不一样使其在食物需求上也可造成不一样结论。第62页穿梭箱试验试验装置试验箱大小为50cm×16cm×18cm。箱底部格栅为能够通电不锈钢棒，箱底中央部有一高1.2cm挡板，将箱底部分隔成左右两列。试验箱顶部有光源，蜂鸣音控制器。训练时，将大白鼠放入箱内任何一侧，20s后开始展现灯光和（或）蜂鸣音，连续15s，后10s内同步给以电刺激(100V，O.2mA，50Hz，AC)。最初，动物只对电击有反应，即逃至对侧以回避电击。20s后再次出现条件刺激并继之在动物所在侧施以电刺激，迫使动物跳至另一侧……如此来往穿梭。当蜂鸣音或／灯光信号展现时，大白鼠立即逃至对侧安全区以躲避电击，即以为出现了条件反应(或称积极回避反应)。每闲天训练一回，每回100次。约训练4—5回后．动物积极回避反应率可达80％～90％。此法可同步观测被动和积极回避性反应.另外．从动物反应次数也能够理解动物系处于兴奋或抑制状态。第63页穿梭箱试验自动统计系统能够输出下列内容：(1)动物序号；(2)遭受刺激次数；(3)遭受刺激时间；(4)积极回避反应时间。以上各值均为在设定穿梭次数内反应总和。遭受电激次数是被动回避次数，该值与设定循环次数之差即为积极回避次数；刺激时间是指动物在被动回避过程受到电刺激时间和，该值愈小，说明动物被动反应愈敏捷，积极回避时间是指动物在接收条件刺激时间长短，该值越短，说明动物积极回避反应越迅速．第64页跳台试验

跳台试验属一次性刺激回避反应试验（ONETRAILAVOIDANCETEST）。装置：试验装置为一长方形反射箱，大小为10cm×10cm×60cm，用黑色塑板分割成5间。地面铺以栅栏，间距0.5cm，能够通电，每间角落置一高和直径均为4.5cm平台。第65页跳台试验原理

在一种开阔空间，动物大部分时间都在边缘及角落里活动。在一种方形中心设置一种高平台，当把动物放在平台时，它几乎立即跳下平台并向四周摸索接近边缘指标潜伏期：统计动物从上平台到第一次下平台时间操作步骤一种典型例子包括三个过程：熟悉过程

学习过程

记忆检测熟悉过程：将动物放在平台上，开始计时，至动物跳下。此时间段为潜伏期。动物摸索10s后来，放回笼中学习过程：动物一旦从平台上跳下后，立即受到电刺激，然后放回笼中记忆检测：学习试验24h后，将试验动物重新放回平台上，统计跳下平台潜伏期。动物跳下平台或连续停留在平台上标志着验结束（终止时间为60s）。将动物放入反应箱内适应环境3min，然后立即通以36V交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。多数动物也许再次或数次跳至栅栏上，受到电击后又迅速跳回平台。如此训练5min，并统计每鼠受到电击次数或叫错误次数（numberoferrors），以此作为学习成绩。24h后重做测试，此即叫记忆保持测试。统计受电击死亡动物数、第一次跳下平台潜伏期和3min内错误次数。第66页三、电生理学办法

电生理学办法包括胞外统计、胞内统计、脑内电刺激、电压钳、膜片钳、脑电图等技术。1、电生理常用仪器

阴极射线示波器:高敏捷度，扫描速度慢

生物电放大器

电子刺激器

贮存和分析电生理试验成果仪器：如示波器照相机和计算机。第67页2、电生理学常用办法

细胞外统计(Extracellularrecording)：把引导电极安放在神经组织表面或附近引导神经组织电活动。胞内统计(Intracellularrecording)：研究神经元基本生物物理特性有力伎俩。EPSP,IPSP,AP(动作电位)脑内电刺激：是研究中枢功能定位办法之一。

第68页顺行冲动统计法(Orthodromicimpulserecording)：就是电刺激某一突触前细胞体、树突或轴突，在此突触后神经元细胞体上统计此刺激引发电活动变化。逆行冲动统计法(Antidromicimpulserecording)：逆行冲动统计法即电刺激神经元轴突主干或末梢，在同一神经元胞体统计反相传导动作电位。

第69页电压钳技术(VoltageClamp)：通过插入细胞内一根微电极向细胞内补充电流，补充电流量正好等于跨膜流出反向离子流，这样虽然膜通透性发生变化时，也能控制膜电位数值不变。通过离子通道离子流与经微电极施加电流方向相反，数量相等。

第70页SG:信号发生器，FBA:反馈放大器，V监测膜电位第71页膜(斑)片钳技术（PatchClamp）：能够从分子水平研究细胞膜离子通道功能，是用玻璃微电极吸管和只含１～３个离子通道，面积为几个平方微米细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜高阻封接，此片膜内开放所产生电流流进玻璃吸管，用一极敏感电流监视器（斑片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。第72页膜片钳（patchclamp）

内尔(Neher)萨克曼(Sakmann)

（1944-）（1942-）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）

合作发明了膜片箝技术，并应用这一技术初次证明了细胞膜上存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能调控至关主要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病发病机理，并提供治疗新途径。二人共获1991年诺贝尔奖。第73页膜片钳第74页典型统计模式：贴附式（Cell-attached或oncell)

内膜向外式(Inside-out)

外膜向外式(Outside-out)

全细胞统计方式(Whole-cellrecording)第75页第76页

第77页第78页脑电波测定:

用双极或单极引导法，将引导电极放在脑活动区颅骨表面之上，能够统计出能变换方向薄弱电流。通过强力放大统计出来电位称脑电图（ＥＥＧ）。

第79页诱发电位:

中枢神经任何部位对于故意刺激感受器官，感受神经、感觉通路上任何一点，或与感觉器官有关任何构造上一点，所产生电变化，叫做诱发电位（evokedpotential)。

第80页典型生物化学办法包括：离心电泳层析质谱等由于生物化学办法与药理学、免疫学等其他学科相结合，又发展了：放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)放射受体免疫印迹等方面四、生物化学办法

第81页1、用离心法分离制备突触小体及突出小体膜突触小体:是指脑组织在等渗溶液中匀浆时，神经末梢细胞膜从轴突上自发断裂、封闭而形成神经末梢单位。它包括突触前膜、突触后膜及致密斑和包围在突触前膜突触小泡(vesicle内含神经递质)，线粒体及胞浆蛋白质。由于突触小体是神经介质及受体主要聚集部位，突触小体制备便成了神经介质及受体基本制备伎俩。

第82页离心（centrifuge）离心技术主要用于多种生物样品分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大离心力作用，使悬浮微小颗粒（细胞器、生物大分子沉淀等）以一定速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒质量、大小和密度。第83页离心离心机种类制备型离心机

一般：（6000rpm下列）高速冷冻（25000rpm下列）超速（可达50000～80000rpm）分析型离心机第84页离心制备型离心办法差速沉降离心法

密度梯度区带离心法（简称区带离心法）

第85页2、层析法:

特点：分离生物活性物质时不使其失活，可大量制备。基本原理：被分离物质与支持物互相作用紧密程度不一样，流洗时被洗脱难易程度不一样。

第86页常用层析办法离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析疏水层析高效液相第87页第88页离子交换层析第89页凝胶过滤层析第90页亲和层析第91页3、放射免疫(radioimmunoassay,RIA)测定神经介质：利用抗体(Ab)特异地识别其抗原（Ag）原理，将抗原标识放射性同位素（*Ag），用来测定与*Ag抗原性相同物质。

第92页4、放射受体测定受体法：

利用标识能作用于不一样靶组织内多种受体递质和激素，从而达成直接测定配体与其受体形成络合物过程和理化特性。第93页5、免疫印迹法（immunoblotting或westernblotting）判定生物分子：是将电泳凝胶分离出来电泳带移到特殊滤膜上，再利用标识抗体与滤膜上某一蛋白质或肽特异结合，使其显色。长处：一是将传统电泳凝胶染色法敏感度提升了100~1000倍，二是RIA与相同，能从多种蛋白质中选择判定出一种特异蛋白质，其敏感性可达1ng，同步又能懂得这一蛋白质分子量，这又是RIA无法达成。第94页6.电泳电泳是指带电颗粒在电场作用下发生迁移过程。电泳技术就是利用在电场作用下，由于待分离样品中多种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质差异，使带电分子产生不一样迁移速度，从而对样品进行分离、判定或提纯技术。电泳技术有很多种办法，介绍最常用两种：第95页水平板式电泳槽垂直板式电泳槽稳压稳流电泳仪第96页蛋白质SDS电泳第97页第98页染色成果第99页琼脂糖凝胶电泳天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物组成中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强电渗现象。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。

琼脂糖凝胶电泳常用于分离、判定核酸:如重组质粒判定，DNA酶谱制作等。第100页琼脂糖浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度/%线状DNA大小/kb0.5

0.7

1.0

1.2

1.5

2.030-1

12-0.8

10-0.57-0.4

3-0.2

2-0.05第101页凝胶制备与电泳第102页样品配制与加样第103页染色和拍照第104页第105页五、分子生物学办法

１、神经生物学研究中常用分子生物学办法基因分子克隆克隆后基因在人工体外体现系统或细胞中体现克隆后基因作为探针研究基因体现组织特异性和发育阶段特异性研究基因转录调控区构造特性有助于理解基因转录调控机制

第106页2、聚合酶链式反应（PCR）：在神经生物学研究中有广泛用途，如可应用它发觉和分析新基因，测定mRNA

第107页３、反向遗传学利用制造体内基因突变办法研究基因及其产物功能：通过制造定向突变变化生物表型办法与传统遗传学所采取通过生物表型确定其基因型办法相反，故称反向遗传学。

第108页４、遗传连锁分析法分离遗传病基因：人类基因组由23条染色体组成，基因组内大约包括5~10万个基因，其中40%在脑内体现。约有1000多种遗传病具有显著中枢神经系统症状，占已知遗传病总数三分之一。

第109页六、脑成像（Brainimaging）技术

利用多