酶的非水相催化课件

第七章酶的非水相催化

enzymenon-aqueouscatalysis第七章酶的非水相催化

enzymenon-aqueous1

主要内容酶非水相催化研究概述酶非水相催化的介质有机介质中酶的催化酶非水相催化的应用主要内容酶非水相催化2一、酶非水相催化研究概述

长期的观点认为:有机溶剂是酶的变性剂、失活剂。在这一传统酶学思想的影响下，酶在有机介质中催化的研究此前几乎毫无进展。

直到1984年，美国Klibanov,A.M.在Science上发表了一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的文章,酶在非水相中催化的研究才取得了突破性的进展。一、酶非水相催化研究概述

长期的观点认为:有机溶剂是3克里巴诺夫Klibanov等的工作

在仅含微量水的有机介质中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。

Ｋlibanov等提出只要条件合适，酶可以在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化。

研究内容：酶不仅可以在水与有机溶剂互溶体系，也可以在水与有机溶剂组成的双液相体系，甚至在仅含微量水或几乎无水的有机溶剂中表现出催化活性。

这一观点是对传统酶学思想（酶只能在水溶液中起作用）的挑战。克里巴诺夫Klibanov等的工作

在仅含微量水的4

从上世纪八十年代中期开始，酶在非水介质中催化反应的研究十分活跃。

现已报导，酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等水解酶类；过氧化物酶、过氧化氢酶、醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、多酚氧化酶、多细胞色素氧化酶等氧化还原酶类和醛缩酶等转移酶类中的十几种酶在适宜的有机溶剂中具有与水溶液中可比的催化活性。从上世纪八十年代中期开始，酶在非水介质中催化反应的研究十分5酶在非水介质中的催化反应的新特征：

①可进行水不溶或水溶性差化合物的催化转化，大大拓展了酶催化作用的底物和生成产物的范围；

②改变了催化反应的平衡点，使在水溶液中不能或很难发生的反应向期望的方向得以顺利进行；

eg:在水溶液中催化水解反应的酶在非水介质中可有效催化合成反应的进行；

③提高了酶区域专一性和对映体专一性，使有目的的调控酶催化的作用的选择性成为可能；酶在非水介质中的催化反应的新特征：

①可进行水不溶或6

④大大提高了一些酶的热稳定性；

⑤由于酶不溶于大多数的有机溶剂，使催化后酶易于回收和重复利用；

⑥可有效减少或防止由水引起的副反应的产生；

⑦可避免水溶液中长期反应时微生物引起的污染；

⑧可方便地对水分敏感的底物进行相关的反应；

⑨当使用挥发性溶剂作为介质时，使反应后的分离过程能耗降低.④大大提高了一些酶的热稳定性；7二、用于酶催化的非水介质

(1)含微量水的有机溶剂

常用

(2)气相研究较少

(3)超临界流体

处于临界温度和临界压力以上，介于气体和液体之间的流体，兼有气体和液体的双重性质。

(4)离子液介质

由有机阳离子与有机阴离子构成的室温下呈液态的低熔点盐类，挥发性低，无毒性。酶在离子液介质具有稳定性好和选择性强的特点。

二、用于酶催化的非水介质

(1)含微量水的有机溶剂常8三、有机介质中酶的催化（一）有机介质反应体系类型微水有机介质体系与水溶性有机溶剂组成的均一体系与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系胶束体系和反胶束体系（二）水对有机介质中酶催化的影响（三）有机溶剂对有机介质中酶催化的影响（四）酶在有机介质中的催化特性（五）酶在有机介质中的催化类型（六）有机介质中酶催化反应条件的控制三、有机介质中酶的催化（一）有机介质反应体系类型9

（一）有机介质反应体系类型

1微水有机介质体系

有机溶剂＋微量的水（酶结合水）

水：维持酶分子的空间构象和催化活性

酶：冻干粉或固定化酶，悬浮于有机介

质之中进行催化反应。

应用最为广泛

（一）有机介质反应体系类型

1微水有机102与水溶性有机溶剂组成的均一体系

水＋极性较大的有机溶剂互相混溶

其含量均较大。

酶和底物：溶解状态

由于极性大的有机溶剂对一般酶的催化活性影响较大，所以能在这类反应体系中进行催化反应的酶较少。2与水溶性有机溶剂组成的均一体系

水＋极性较大的有机溶113与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系

水＋疏水性较强的有机溶剂

游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，而疏水性底物或产物则溶解于有机溶剂相中。

仅适用于底物和产物或其中的一种是疏水化合物的酶催化反应。其中，最常用的是两相体系。3与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系

水＋疏水124胶束和反胶束体系

当水和有机溶剂同时存在于反应体系时，加入表面活性剂后，两性的表面活性剂会形成球状或椭球状的胶束，其大小与蛋白质分子在同一数量级上。4胶束和反胶束体系

当水和有机溶剂同时存在于反应体13酶的非水相催化ppt课件14

当体系中水浓度远高于有机溶剂时，形成胶束。表面活性剂的极性端朝向胶束的外侧，而非极性端则朝向胶束的中心，有机溶剂就被包在胶束的内部，此时的胶束就称为正相胶束或简称为胶束；水包油微滴

当体系中水浓度远低于有机溶剂时，形成反胶束。表面活性剂的极性端朝向胶束的中心，而非极性端则朝向胶束的外侧，水就被包在胶束的内部，此时的胶束就称为反相胶束或简称为反胶束。油包水微滴当体系中水浓度远高于有机溶剂时，形成胶束。表面活性剂15

一般而言，在不同的非水介质中进行酶催化时所表现出的催化行为是有区别的。

一般而言，在不同的非水介质中进行酶催化时所表现出的催16不同反应体系中酶的一些催化行为比较参数微水有机介质体系水-有机溶剂两相体系反胶束体系酶活力酶负载量产率产物回收酶重复使用连续操作低高低容易可能可能低高低一般难可能高低高难难难不同反应体系中酶的一些催化行为比较参数微水有机介质体系水-有17（二）水对非水介质中酶催化的影响

酶只有在一定量水的存在下，才能进行催化反应，特别是在有机介质中的酶催化反应，水含量的多少对酶的空间构象、催化活性、稳定性、催化反应的速度、底物和产物的溶解度等都有密切关系。（二）水对非水介质中酶催化的影响

酶只有在一定量水的181必需水

维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量。

氢键、盐键等次级键。

在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。

通过必需水的调控，可以调节有机介质中酶的催化活性和选择性。1必需水

维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水192.水活度

Aw

有机介质反应体系中含有的水主要有两类:

一类是与酶分子紧密结合的结合水;

另一类是溶解于有机溶剂的游离水，可以认为，在有机介质反应体系中，结合水是影响酶催化活性的关键因素。

水活度：近似等于相同条件下体系中水的蒸气压（P）与纯水蒸汽压（Po）之比。

2.水活度Aw

有机介质反应体系中含有的水203水对酶催化反应速度的影响

最适水含量

水间接或直接地参与了酶天然构象中包括氢键、静电作用、疏水相互作用和范德华力在内的所有非共价相互作用。

3水对酶催化反应速度的影响最适水含量

21

酶蛋白分子的水化过程分为四步：

①酶蛋白分子的离子化基团水化过程。水与酶蛋白分子表面的带电基团结合；

②酶蛋白分子中的极性部分水簇的生长过程。即水与酶蛋白分子表面极性基团合；

③水吸附到酶蛋白分子表面相互作用较弱的部位；

④酶蛋白分子表面完全水化，被单层水分子所覆盖。酶蛋白分子的水化过程分为四步：

①酶蛋白分子的离子22大量研究表明，非水介质中酶的活性比水溶液中要低酶在有机溶剂中活力低的原因原因说明解决办法扩散限制有机溶剂中的扩散要比水中小，限制了底物的扩散增加搅拌速度；降低酶的颗粒大小封闭活性中心导致酶活力降低几倍用结晶酶替代构象改变冻干过程及其他脱水过程造成的使用冻干保护剂；制备有机溶剂中可溶解的可与两亲性物质络合的酶底物去溶剂化疏水性底物严重，可导致酶活力降低至少100倍选择溶剂以获得有利的底物-溶剂相互作用过渡态不稳定化当过渡态至少部分暴露于溶剂时才发生选择溶剂以期获得与过渡态有利的相互作用构象柔性降低无水的亲水溶剂尤为显著，会夺取酶分子上必需的结合水，从而导致酶活力降低至少100倍使水活度(aw)最适化；水合溶剂;使用疏水溶剂；使用仿水和变性共溶添加剂最适pH值导致至少100倍的酶活力降低从酶的最适pH水溶液中脱水；使用有机相缓冲液大量研究表明，非水介质中酶的活性比水溶液中要低酶在有机溶剂中23在低水含量的非水介质酶催化体系中，水分的影响是至关重要的，要使酶能够表现出最大的催化活力，确定适宜的水活度就显得十分重要。不同种类的酶因为其分子结构的不同，维持酶具有活性构象的必需水量也就不同，即使是同一种类的酶，由于酶的来源不同，所需的水量也会有显著不同。

最适水含量：催化反应速度达到最大时的水含量。最适水含量随溶剂极性的增加而增加。最佳水活度与溶剂极性大小没有关系，可以确切研究非水介质酶催化作用，一般控制在0.5-0.6之间。在低水含量的非水介质酶催化体系中，水分的影响是至关重24

（三）有机溶剂对酶催化反应的影响

1有机溶剂对酶结构的影响

2有机溶剂对酶催化活力的影响

3有机溶剂对底物和产物的影响

4有机溶剂对酶选择性的影响

（三）有机溶剂对酶催化反应的影响

1有机溶剂对酶结构的25

酶在非水介质中的存在形式

一、固态酶。

冻干酶粉、固定化酶、结晶酶

以固体形式悬浮在有机溶剂中

二、可溶解酶。

水溶性大分子共价修饰酶

非共价修饰的高分子—酶复合物

表面活性剂—酶复合物

微乳液中的酶等

酶在非水介质中的存在形式

一、固态酶。

冻干酶粉、261有机溶剂对酶结构与功能的影响

1）对酶分子表面结构的影响

eg：枯草杆菌蛋白酶晶体，原来有119个水分子与酶分子结合。悬浮于乙腈中后，仅有99个水分子与酶分子结合，而有12个乙腈分子也结合到酶分子上，其中有4个是原来水分子的结合位点。

1有机溶剂对酶结构与功能的影响

1）对酶分子表面结构的影响272）对酶活性中心结合位点的影响有机溶剂渗入酶分子活性中心，与底物竞争活性中心的结合位点。eg:辣根过氧化物酶在甲醇中催化时，甲醇分子可以进入酶的活性中心，与卟啉铁配位结合。有机溶剂渗入酶分子活性中心，降低活性中心的极性，降低酶与底物的结合力。eg:枯草杆菌蛋白酶晶体悬浮于乙腈中，有4个乙腈分子进入酶活性中心。2）对酶活性中心结合位点的影响28

2有机溶剂对酶活性的影响

极性较强的有机溶剂能够夺取酶蛋白表面的“必需水”，扰乱酶分子的天然构象的形成，从而导致酶的失活。极性系数lgP：P为溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。lgP越小，极性越强。lgP小于2的极性溶剂不宜使用。

在有机介质中进行酶催化时，应选择好所用溶剂，或通过酶分子修饰提高酶的亲水性。

2有机溶剂对酶活性的影响极性较强的有机溶剂能够夺取29

3有机溶剂对底物和产物分配的影响

有机溶剂能改变酶分子“必需水”层中底物或产物的浓度，而底物必须渗入“必需水”层，产物必须移出此水层，才能使反应进行下去。有机溶剂极性很小，疏水性太强，疏水性底物虽然在有机溶剂中溶解度大，浓度高，但很难进入必需水层，与酶分子结合力低，酶催化速度降低；有机溶剂极性很大，亲水性太强，疏水性底物在有机溶剂中溶解度低，底物浓度低，也使酶催化速度降低；适宜的有机溶剂极性为2≤lgP≤5。3有机溶剂对底物和产物分配的影响有机溶剂能改变30有机溶剂对酶催化反应的影响是一个综合而复杂的过程，其中包括溶剂对水-酶相互作用的扰动和扭曲、与固定化酶微环境之间的匹配以及对底物和产物的溶剂与扩散等因素。目前的模型都是在针对特定的酶、底物和体系的研究过程中建立起来的，尚不足以总结出普遍适用的规律。有机溶剂对酶催化反应的影响是一个综合而复杂的过程，其31

4有机溶剂对酶选择性的影响

有机溶剂对酶选择性的影响很大，由于有机溶剂的存在使酶蛋白分子的刚性得以增强，使之具有水溶液中所不可比拟的优越性：良好的对映体选择性或区域选择性。4有机溶剂对酶选择性的影响

有机溶剂对酶选择性32（四）酶在非水介质中的性质热稳定性底物专一性对映体选择性区域选择性化学键选择性

pH记忆（四）酶在非水介质中的性质热稳定性33

1热稳定性

许多酶在非水介质中的热稳定性和储存稳定性比相同酶在水溶液中更好，且随着介质中水含量的增加，热稳定性会降低。

这种热稳定性和储存稳定性的提高是难以用化学交联、固定化甚至是蛋白质工程的手段所能达到的，且这种稳定性还与介质中的水含量有关。1热稳定性 许多酶在非水介质中的热稳定性和34

原因水分子会引起酶分子中Asn及Gln的脱氨基，还可能引起Asn肽键的水解，Cys的氧化，二硫键的破坏等。原因水分子会引起酶分子中Asn及Gln的脱氨基，还35eg:猪胰脂肪酶在有机溶剂中100℃时的半衰期可达数小时，而在水中100℃几乎马上失活。1%的水浓度会使猪胰脂肪酶的稳定性降低到与水溶液中相同的水平。eg:胰凝乳蛋白酶在无水辛烷中20℃放置6个月后酶活力没有降低，而在同样温度下酶在水溶液中的半衰期仅有几天。eg:猪胰脂肪酶在有机溶剂中100℃时的半衰期可达数小时36酶条件热稳定性猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯,水，pH7.0T1/2<26hT1/2<2min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇水，pH7.0T1/21.5hT1/2<2min胰凝乳蛋白酶正辛烷，100℃水，pH8.0,55℃T1/280minT1/215min枯草杆菌蛋白酶正辛烷，110℃

T1/280min溶菌酶环己烷110℃水T1/2140minT1/210min核糖核酸酶壬烷，110℃，6h水，pH8.0,90℃剩95%活性T1/2<10minF1-ATP酶甲苯，70℃水，70℃T1/2>24hT1/2<10min醇脱氢酶正庚烷，55℃

T1/2>50days酪氨酸酶氯仿，50℃水，50℃T1/290minT1/210min酸性磷酸酯酶正十六烷，80℃水，70℃T1/28.0minT1/21.0min细胞色素氧化酶甲苯，0.3%水甲苯，1.3%水T1/24.0hT1/21.7min酶条件热稳定性猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯,T1/2<2637

2底物专一性水溶液中，E与S结合靠疏水作用，疏水性强的底物易与E活性中心结合，催化效率高；有机溶剂中，有机溶剂与S之间的疏水作用大于S与E之间的疏水作用，疏水性强的底物易与有机溶剂结合，催化效率低；eg:胰蛋白酶：水中辛烷介质中N－乙酰－L－丝氨酸乙酯N－乙酰－L－苯丙氨酸乙酯高104倍快20倍催化效率低

疏水性强2底物专一性水溶液中，E与S结合靠疏水作用38

不同的有机溶剂具有不同的极性，因此在不同的有机溶剂中酶的底物专一性也不同。

一般来说，在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易进行反应，而在非极性较强的有机溶剂中，亲水性较强的底物容易进行反应。 不同的有机溶剂具有不同的极性，因此在不同的有机溶剂中酶的39

3对映体选择性（立体异构专一）

酶的对映体选择性是指酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力，这种选择性是由不同对映体与酶的活性中心的三维空间构像的互补性或称亲和力决定的。

非水介质中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲（疏）水性的变化而发生改变。3对映体选择性（立体异构专一） 酶的对映体选择40立体选择系数KLD越大，酶催化的对映体选择性越强。酶在水溶液中的对映体选择性较强，而在疏水性较强的有机溶剂中，酶的对映体选择性较差。eg：蛋白酶在水溶液中只对含有L－aa的蛋白起作用，水解生成L－aa。而在有机介质中，某些蛋白酶可以用D－aa为底物合成由D－aa组成的多肽，可用于手性药物的制造。立体选择系数41

4区域选择性

区域选择性，即酶能够选择性地优先催化底物分子中某一区域的基团进行反应。酶在非水介质中进行催化时，区域选择性可能会发生一定变化。eg:用脂肪酶催化1，4－二丁酰基－2－辛基苯与丁醇间的转酯反应，在甲苯介质中，区域选择系数K4,1＝2，表明酶优先作用于底物C4位上的酰基；而在乙腈介质中，K4,1＝0.5，表明酶优先作用于底物C1位上的酰基。K1,2=（Kcat/Km）1/（Kcat/Km）24区域选择性 区域选择性，即酶能够选择性地优先催化底物42

5化学键选择性

当同一个底物分子中有2个以上的化学键都可以进行反应时，酶对其中的一个化学键可以优先进行催化反应。

化学键选择性与酶的来源与有机介质中的种类有关。eg:脂肪酶催化6－氨基－1－己醇的酰化反应，底物分子中的氨基和羟基都可能被酰化，分别生成肽键和酯键。用黑曲霉脂肪酶催化时，优先使羟基酰化；用毛霉脂肪酶催化时，优先使氨基酰化。而在不同的有机介质中，氨基与羟基的酰化程度也不同。5化学键选择性 当同一个底物分子43

6pH记忆(pH印记)

在有机介质酶催化反应中，酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体之前所使用的缓冲液pH值相同。

非水介质中的酶能够“记忆”冻干或吸附到载体之前所处缓冲液中的pH值，反应的最适pH接近于水溶液中的最适pH。有机介质中酶催化反应pH的控制：1.控制冻干前缓冲溶液pH为最适pH。使非水介质中的酶能够“记忆”2.采用有机相缓冲液会破坏pH记忆。疏水性酸与对应的盐疏水性碱与对应的盐6pH记忆(pH印记)在有机介质酶催化反44（五）非水介质中的酶催化反应类型C-O键的形成C-N键的反应C-C键的形成还原反应氧化反应异构化反应C-X的反应卤化反应

（五）非水介质中的酶催化反应类型C-O键的形成45ee值(对映体过量,enantiomericexcess)手性分子的两个对映体中，各对映体都把平面偏振光旋转到一定的角度，其数值相同但方向相反，这种性质称为光学活性。化合物样品的对映体组成可用对映体过量或“e.e.%”来描述。它表示一个对映体对另一个对映体的过量，通常用百分数表示。其光学纯度(e.e.值)可从测定的比旋值来计算。ee值(对映体过量,enantiomericexcess461.C-O键的形成

（1）酯类：酯酶和脂肪酶可催化

酯合成反应、转酯反应和酸酐水解反应。

（2）环氧化合物

（3）糖苷键的水解和形成

（4）加氧氧化反应

1.C-O键的形成

（1）酯类：酯酶和脂肪酶可47

酯合成反应

酯合成反应48

转酯反应转酯反应49

酸酐水解

酸酐水解50

环氧化合反应

环氧化合反应51

糖的焦磷酸化，糖的异构化

糖的焦磷酸化，糖的异构化52

糖的衍生物糖的衍生物53

醇解

醇解54加氧氧化反应

加氧氧化反应552.C--N键的反应 肽的合成2.C--N键的反应 肽的合成563.C-C键的形成

（1）羟醛反应

（2）酮醛和羟醛转移反应

（3）醛缩合反应

（4）乙酰辅酶A参与的C-C键构成反应

（5）醛加成反应3.C-C键的形成

（1）羟醛反应

（2）酮醛和羟醛转移反57（1）羟醛反应（1）羟醛反应58酶的非水相催化ppt课件59（2）酮醛和羟醛转移反应

（2）酮醛和羟醛转移反应60（3）醛缩合反应（3）醛缩合反应61（4）乙酰辅酶A参与的C-C键构成反应

（4）乙酰辅酶A参与的C-C键构成反应62（5）醛加成反应（5）醛加成反应63

4.还原反应4.还原反应645.氧化反应

（1）C-H,C=C氧化

（2）醇氧化

（3）苯酚氧化

（4）羧酸氧化

（5）C-N氧化

5.氧化反应

（1）C-H,C=C氧化

（2）醇65（１）C-H,C=C氧化（１）C-H,C=C氧化66（２）醇氧化（２）醇氧化67（3）苯酚氧化（3）苯酚氧化68（４）羧酸氧化（４）羧酸氧化69（5）C-N氧化（5）C-N氧化70

6.异构化反应

6.异构化反应71

7.C-X的反应卤化反应：7.C-X的反应卤化反应：72（六）有机介质中酶催化反应条件的控制1.酶的选择催化速度稳定性专一性选择性2.底物的选择及浓度控制极性和浓度3.有机溶剂的选择lgP控制在5—2为宜。4.水含量的选择水活度控制为0.5-0.65.温度的控制适宜的温度6.pH的控制与水相催化的最适PH相同或相近（六）有机介质中酶催化反应条件的控制1.酶的选择催化速度73四、非水介质酶催化的应用手性药物的拆分手性高分子聚合物的制备酚树脂的合成导电有机聚合物的合成发光有机聚合物的合成食品添加剂的生产生物柴油的生产多肽的合成甾体转化四、非水介质酶催化的应用手性药物的拆分74

迄今为止，已有以脂肪酶、蛋白酶为典型代表的多种酶被用于非水介质中催化酯化、酯交换、肽合成和大环内酯合成等多种反应，其中特别在前手性化合物的不对称合成、对映体的选择性拆分等方面获得了有重要意义的应用。迄今为止，已有以脂肪酶、蛋白酶为典型代表的多种751光学活性化合物的制备

A可以将有潜在手性的化合物和前体通过酶催化反应转化为单一对映体的光学活性；

B可以非水介质中的酶催化反应合成含磷、硫、氮及金属的光学活性化合物；

C可以利用非水介质中的酶催化进行外消旋化合物的拆分反应。1光学活性化合物的制备

A可以将有潜在手性的化合物和前76①普萘洛尔的酶法拆分

利用PSL（假单胞菌脂肪酶）在有机溶剂中可对外消旋的萘氧氯丙醇酯进行水解，得到了(R)－酯的ee值大于95%；而利用PSL对消旋的萘氧氯丙醇进行选择性酰化，也得到