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小鼠组织中超氧阴离子自由基的测定
自由基是具有一定生理功能的自身代谢产品。11.1胺、酰氯及酰胺四甲基乙二胺(TMEDA),天华试剂有限公司;过硫酸铵,成都市方舟化学试剂厂;α-萘胺,天津市光复精细化工研究所;无水对氨基苯磺酸,成都市科龙化工试剂厂;盐酸羟胺,上海三浦化工股份有限公司;均为分析纯。UV1000紫外可见分光光度计,上海天美科学仪器有限公司。昆明种小鼠,一级,雌雄各半,体重(28±4)g,由四川大学华西医学动物养殖中心提供。1.2过硫酸铵溶液的配制TMEDA溶液的制备:取TMEDA0.23mL用pH7.8的磷酸钾缓冲液配制成1.49×10过硫酸铵溶液的制备:称取过硫酸铵0.14g,去离子水溶解后定容到100mL制成6.14×1022.1反应物法制备超氧阴离子根据羟胺定量反应的原理即超氧阴离子自由基和盐酸羟胺定量反应生成亚硝酸根离子,亚硝酸根离子与对氨基苯磺酸发生重氮化反应。重氮化的对氨基苯磺酸再与α-萘胺反应生成粉红色的偶氮染料这一连续的反应过程可以间接测定出超氧阴离子的含量。采用不同比例的过硫酸胺和TMEDA可以产生相应不同比例的超氧阴离子自由基,从而验证了方法的线性和精密度。采用亚硝酸钠模拟中间产物亚硝酸根离子得到亚硝酸钠溶液的标准曲线,再用同样的方法测定小鼠组织中的自由基,根据亚硝酸钠溶液的标准曲线,可以计算得到对应的自由基的含量。2.2高效液相萃取法分别采用体积比为1∶0.5,1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,1∶5,1∶6的过硫酸胺溶液和TMEDA溶液,反应3min后取混合液2mL与10mmol/L盐酸羟胺溶液0.4mL在25℃恒温水浴中反应20min。再加入58mmol/L对氨基苯磺酸溶液2mL和7mmol/Lα-萘胺溶液2mL,混匀后于25℃恒温水浴中反应20min。最后加入三氯甲烷3mL做萃取剂,混匀后静置10min,取分层后的上层液体测定529nm波长处的吸光度。以吸光度(2.3方法的精度取高、中、低3个浓度比例的过硫酸胺和TMEDA溶液,1d内按2.2项下方法操作,平行测定3次,2.4盐酸羟胺的合成采用亚硝酸钠模拟中间产物亚硝酸根离子,分别配制一系列不同浓度亚硝酸钠溶液,取混合液0.4mL与10mmol/L盐酸羟胺溶液0.4mL,在25℃恒温水浴中反应20min。照2.2项下自“再加入58mmol/L对氨基苯磺酸2mL”起操作。以吸光度(2.5标准曲线方程昆明种小鼠,实验前禁食24h,自由饮水。眼球取血后颈椎脱臼处死,迅速解剖。取出心,肝,脾,肺,肾,脑,用缓冲液冲洗组织表面血液,滤纸吸干。分别称重,匀浆,8000r/min离心20min,取组织上清液0.2mL,加入10mmol/L盐酸羟胺溶液0.2mL,25℃反应20min,加入对氨基苯磺酸溶液和α-萘胺溶液各1.0mL,25℃反应20min。加入三氯甲烷1mL做萃取剂,混匀静置10min后取上清液以8000r/min离心20min,取上层液测定529nm波长处的吸光度。由标准曲线方程,计算出各组织单位重量自由基浓度和组织中自由基的总量,结果见表1。小鼠组织中,心和肝的单位重量自由基浓度远大于肺,脾,肾和脑;小鼠肝组织中自由基总量远远高于心,脾,肺,肾和脑。3采用抗氧化药物注射增加细胞自由基的方法ESR是目前检测自由基的直接有效的手段,但设备昂贵而且测定样品具时限性,不能满足一般实验室测定要求。常用的荧光法测定自由基虽然灵敏度较高但不能准确定量,且精密度和重现性较低。电化学方法是现在比较新颖的测定自由基的方法,灵敏度较常规分光光度法高,但对电极的要求较高,制备电极比较麻烦。本文采用羟胺定量反应原理测定自由基,所需测定仪器为一般实验室具备,所用试剂价廉易得,可以同时平行测定多个样品,方法的线性、精密度均较高,能够满足实验室的需要,可以用作抗氧化药物筛选的方法。本法操作过程简单,实验中室温需恒定为15℃,制备组织上清液时间控制在2h内可以有效的维持自由基的含量。实验中用三氯甲烷作为萃取剂,便于沉淀蛋白等杂质在下层,取上层水层测定吸光度,操作更方便安全。采用12mol/L乙酸作α-萘胺溶液的溶剂可以控制pH值在一定范围内,利于反应的最终产物的形成。实验中采用眼球取血的方法可以减少血液中色素和蛋白对组织中自由基测定的干扰。另外采用了维生素C溶液作为体系产生自由基的对照实验,维生素C是一种强还原剂,可与自由基发生氧化还原反应。维生素C溶液在400~600nm范围内没有吸收。过硫酸胺和TMEDA反应体系产生的自由基在这一范围内有吸收,加入维生素C后吸收峰减弱或消失,证明过硫酸胺和TMEDA反应体系产生自由基。实验结果表明肝组织中自由基的总含量远高于其他组织,这可能是因为肝中含有大量的酶,其中包括黄嘌呤氧化酶等可以催化生成氧自由基的多种酶。另外肝组织中血液循环丰富,相对其他组织游离氧含量高,更利于产生大量的自由基。本实验测定的为生物样品,应该做回收率试验,但由于未能找到自由基标准品,若直接使用化学药品模拟产生自由基可能存在化学成
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