基因组文库、cDNA文库的构建和筛选课件

基因组文库、cDNA文库的构建和筛选基因组文库、cDNA文库的构建和筛选基因文库—是来自于某种生物的不同

DNA序列的集合基因组文库—用于构建文库的DNA来源于基因组DNAcDNA—用于构建文库的DNA是mRNA群体的拷贝（cDNA），则该文库称之为cDNA文库。cDNA文库不包括不能转录的核基因序列具有代表性的基因文库应该在最大限度上覆盖所有的原初序列。基因文库—是来自于某种生物的不同

DNA序列的集合基因组文库文库大小以最大可能可获得某一特定序列的基因文库所必须包含的重组体数的计算方式如下：

N＝ln(1-p)/ln(1-f)P—给定的概率，f—插入片段大小占总基因组大小的比例如果给定概率为0.99，插入片段为20kb的情况下，对人类基因组（3*109bp）来说，所需重组体的数目为6.9*105；而对于大肠杆菌而言，仅需要1100个重组体。文库大小以最大可能可获得某一特定序列的基因文库所必须包含的重因此，插入大小仅有5－10kp的质粒就可以很好地构建原核生物的基因组文库，因为只需要几千个重组体就够了。而对于较大的基因组，较大的插入片段可以使所需的重组体数量减少，这也正是开发黏粒以及YAC载体的原因。因此，插入大小仅有5－10kp的质粒就可以很好地构建原核生物基因组DNA为了构建具有代表性的基因文库，必须将纯化后的基因组DNA进行随机切割，产生适合克隆进所用载体的大小合适的片段真核生物基因组DNA的提取提取细胞核—为了防止器官（叶绿体、线粒体）DNA的污染蛋白酶降解及分相抽提—去除蛋白质、脂类以及其他的大分子杂质原核细胞基因组DNA的提取直接抽提DNA基因组DNA为了构建具有代表性的基因文库，必须将纯化后的基经提取的基因组DNA是由染色体断裂而成的数百kb大小的长片段构成长片段的进一步切割。纯化的基因组DNA需要用物理剪切或限制性酶解切割成载体适用的片段（15~25Kb或更大）。

经提取的基因组DNA是由染色体断裂而成的数百kb大小的长片段

物理剪切—利用振荡、超声等物理方法剪切可以非常随机地进一步将长片段切割成小片段，片段末端通常都是平末端限制性酶解—位点非随机分布。常用的酶是Sau3A，该酶产生的酶切黏性末端与BamHI酶解载体产生的末端相同物理剪切—利用振荡、超声等物理方法剪切可以非常随机地进基因组DNA片段的限制性内切酶酶解使用限制性内切酶酶解基因组DNA可产生非随机片段，为了获得15－25kb的或更大的基因组DNA片段（适用于λ噬菌体或黏粒载体的片段），需要进行部分酶解，即通过合理使用限制性内切酶（种类和用量），调节酶切片段的大小合适的酶切片段可由琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度纯化回收基因组DNA片段的限制性内切酶酶解使用限制性内切酶酶解基因组基因组DNA文库的构建流程提取切割整合转化基因组DNA文库的构建流程提取质粒载体质粒载体蓝白筛选蓝白筛选YAC载体YAC载体基因组文库、cDNA文库的构建和筛选课件置换型载体允许外源DNA片段替换非必须DNA片段的载体，称为置换型载体（replacementvectors）。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是9-23kb，故而该载体主要用来构建基因组文库。如λ置换载体（EMBL3等）

置换型载体允许外源DNA片段替换非必须DNA片段的载EMBL3：载体大小为43kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为20kb、9kb和14kb。从提高克隆效率角度来看，它们克隆DNA片段的大小为9-23kb。在填充片段中带有

red和

gam基因，当外源片段替换填充片段后，重组体将变成

red-gam-，同时载体上含有

chiC位点，因此可用P2噬菌体的溶源性大肠杆菌进行Spi筛选重组体。在填充片段两端带有对称的多克隆位点。EMBL3：载体大小为43kb，其左臂、右臂和填充片段载体质粒载体—用于基因组较小的生物，如大肠杆菌，用质粒载体来构建基因组文库，只需5000个克隆就可以达到高于99％的覆盖率构建较大的基因组文库*λ噬菌体—最大可插入片段，23kb

黏粒—45kb

细菌人工染色体（BAC）—350kb

酵母人工染色体(YAC)—1000kb20060427载体质粒载体—用于基因组较小的生物，如大肠杆菌，用质粒载体来cDNA文库mRNA分离、纯化与分离cDNA的合成cDNA末端的处理与载体的连接cDNA文库mRNA分离、纯化与分离mRNA分离、纯化与分离通常用于构建cDNA的是真核细胞的mRNA由于cDNA从mRNA合成而来，代表了基因组的可转录部分，不含内含子序列，因此可被用于在大肠杆菌中表达编码蛋白由于每类细胞和组织只表达一套特定的基因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会富集某些特异序列。所以有一个起始材料的选择问题。mRNA分离、纯化与分离通常用于构建cDNA的是真核细胞的mmRNA的提取全长mRNA具有一个polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分离；可以用寡聚纤维素柱，选择性地吸附mRNA纯化mRNA的提取全长mRNA具有一个polyA的3’末端，可以用结合有寡聚（dT）的磁珠加到细胞裂解液，在用强磁铁吸出磁珠并洗出mRNA。用结合有寡聚（dT）的磁珠加到细胞裂解液，在用强磁铁吸出磁检测mRNA翻译，检测翻译产物：用无细胞翻译系统（如麦胚抽提液或兔网织红细胞裂解液）来检测mRNA的完整性，也可用凝胶电泳直接检测，用杂交法分离mRNA。检测mRNA翻译，检测翻译产物：示差筛选（DifferentialScreening）示差筛选（DifferentialScreening）扣除文库(subtractivelibrary)扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractivecDNAcloning)，它是通过构建扣除文库(subtractivelibrary)得以实现的。差别杂交对于因特殊处理而被诱发产生的mRNA之cDNA克隆的分离，或是在细胞中具高表达效率的mRNA之cDNA克隆的分离，无疑是一种有效的方法，但对于低丰度的mRNA之cDNA克隆的分离则有相当的困难。为了进一步提高差别杂交的筛选效率，一种切实可行的办法是构建富含目的基因序列的cDNA文库。应用扣除杂交筛选法便可达到此种目的。

扣除文库(subtractivelibrary)扣除杂交又扣除杂交（SubtractiveHybridization）

扣除杂交（SubtractiveHybridization扣除杂交法已成功构建了非洲爪蟾原肠期，鼠T淋巴细胞及大鼠前脑等特异性cDNA文库。扣除杂交法已成功构建了非洲爪蟾原肠期，鼠T淋巴细胞及大鼠前脑cDNA的合成用反转录酶通过向引物（一般为寡聚dT）的3’

末端添加dNTP来合成cDNA的第一条链。用末端转移酶对cDNA的第一条链的3’末端加尾很容易合成全长的第二链。也可用反转录酶或Klenow酶延伸引物来合成第二链。

cDNA的合成用反转录酶通过向引物（一般为寡聚dT）的3’基因组文库、cDNA文库的构建和筛选课件基因组文库、cDNA文库的构建和筛选课件基因组文库、cDNA文库的构建和筛选课件cDNA末端的处理由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链cDNA的末端进行加工是十分必要的方法：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆的黏性末端cDNA末端的处理由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了cDNA末端的处理先用单链特异性核酸酶切掉凸出的3/端，再用Klenow酶补平后加上接头。为避免限制性内切核酸酶切割cDNA内部，在添加接头前先用EcoRⅠ甲基化酶甲基化。最后用T4DNA连接酶连接。cDNA末端的处理先用单链特异性核酸酶切掉凸出的3/端，再cDNA末端的处理末端转移酶—可以向cDNA末端加上与克隆载体末端互补的尾部cDNA末端的处理末端转移酶—可以向cDNA末端加上与克隆载末端转移酶末端转移酶末端转移酶末端转移酶与载体的连接载体先用碱性磷酸酶去磷酸化以防止载体自连接。T4DNA连接酶连接载体与cDNA。噬菌体λgt11是构建表达文库的最适载体与载体的连接载体先用碱性磷酸酶去磷酸化以防止载体自连接。质粒载体：cDNA相对较短。噬菌体载体：构建表达cDNA文库质粒载体：cDNA相对较短。与载体的连接与载体的连接基因组文库、cDNA文库的构建和筛选课件筛选流程筛选流程筛选从基因文库的大量克隆中鉴定出某个含有目的基因的特定克隆的过程，称为筛选筛选过程通常需要一个核酸探针进行杂交，该探针可以与其互补序列结合从而检测出含目的基因的克隆。将菌落或噬菌斑转移到膜上，将其置入含放射性标志探针溶液中保温，检出相应克隆。通常构建核酸探针，要求了解其基因序列或表达产物（蛋白质）的信息筛选从基因文库的大量克隆中鉴定出某个含有目的基因的特定克隆的探针的制作方法

用聚合酶链式反应（PCR）制作探针从目的基因的表达产物（蛋白质）的序列信息，可以派生出其可能的DNA序列混合物，根据该序列信息，可以采用PCR技术构建核酸探针PCR探针寡聚核苷酸探针：合成仪探针的制作方法用聚合酶链式反应（PCR）制作探针平板杂交筛选克隆DNA转移到尼龙膜上；膜上的DNA在碱性条件下变性，解聚形成单链；再通过烤膜或紫外线照射，单链将与膜紧密结合；再将膜置于含有放射性标记的核酸探针的溶液中保温，使探针与其互补序列进行杂交；杂交后充分洗去未杂交的探针，然后可由放射性自显影鉴定。平板杂交筛选克隆DNA转移到尼龙膜上；膜上的DNA在碱性条件（1）原位杂交筛选特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。原位杂交筛选

（1）原位杂交筛选特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。（1）原位杂交筛选特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接基因组文库、cDNA文库的构建和筛选课件寡聚核苷酸探针寡聚核苷酸探针抗体探针表达筛选通过抗体筛选来检测cDNA编码的蛋白质抗体探针表达筛选通过抗体筛选来检测cDNA编码的蛋白质质粒蛋白A外源蛋白BcDNA表达为与β半乳糖苷酶相嵌合的目的基因的融合蛋白，用抗血清来筛选目的cDNA编码的融合蛋白。筛选流程与噬菌斑杂交程序相似。质粒蛋白A外源蛋白BcDNA表达为与β半乳糖苷酶相嵌合的目的杂交扣留和释放cDNA与mRNA杂交后可抑制某些mRNA的翻译(杂交扣留翻译).杂交的mRNA被纯化后进行翻译(杂交释放翻译)可鉴定cDNA克隆编码的蛋白

杂交扣留和释放cDNA与mRNA杂交后可抑制某些mRNA的翻染色体步移(Chromosomewalking)从文库中分离相邻基因组克隆来克隆目的基因即为染色体步移.

染色体步移(Chromosomewalking)从文库中染色体步移是先用与疾病基因最接近的标记DNA做为探针从基因库找出一个能够与它杂交的DNA片段。这个片段应当包含标记DNA的序列。假使这片段够长的话，它也有可能包含所要的疾病基因，问题就此解决。不过，基因库内的DNA片段长度有限。如果疾病基因与标记DNA的距离比载体携带的DNA片段还长，用标记DNA筛选出的DNA片段必定没有包含疾病基因。染色体步移是先用与疾病基因最接1980年代，研究人员迫切地寻找CFTR及HD基因时尚无YAC可用。疾病基因与标记DNA