代谢控制发酵(全套课件746P)

代谢控制发酵课程第一章微生物的代谢第一节微生物的代谢体系

代谢（Metabolism）是细胞内发生的各种化学反应的总称，也就是发生在微生物细胞内各种生物化学反应的总称。(catabolism)(anabolism)分解代谢合成代谢

合成代谢与分解代谢在生物体中耦联进行，它们之间既有明显差别，但又紧密相关。分解代谢为合成代谢提供所需要的能量和原料，而合成代谢则是分解代谢的基础。在代谢过程中，微生物通过分解代谢产生化学能，光合微生物还可将光能转换成化学能，这些能量除用于合成代谢外，还可用于微生物的运动和运输，另有部分能量以热或光的形式释放到环境中去。

初级代谢和次级代谢初级代谢：能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或提供生长能量的一类代谢。产物有小分子前体物、单体、多聚体等生命必需物质；次级代谢：某些微生物在一定生长时期出现的一类代谢。产物有抗生素、酶抑制剂、毒素、甾体化合物等，与生命活动无关，不参与细胞结构，也不是酶活性必需，但对人类有用。二者关系：先初后次，初级形成期也是生长期，只有大量生长，才能积累产物。第二节微生物产能与耗能代谢

一、能量转换

ATP是能量转换的枢纽物质1.底物水平磷酸化（SubstrateLevelPhosphorylation）——不需氧通过转移底物在生物氧化过程中形成的高能化合物的高能磷酸键，直接形成ATP的过程称为底物水平磷酸化。特点：底物在生物氧化中脱下的电子或氢不经过电子传递链传递，而是通过酶促反应直接交给底物自身的氧化产物，同时将释放出的能量(一般通过高能磷酸键)交给ADP，形成ATP。底物水平磷酸化是微生物在发酵中产生ATP的唯一方式，在呼吸过程虽也存在，但处于次要地位。底物在生物氧化过程中放出的电子通过电子传递链传到氧或其他氧化物(如NO3-1)，同时形成ATP的过程称为氧化磷酸化或电子传递磷酸化。其核心为电子传递链（ETC,electrontransportchain)，或称为呼吸链（RC,respiratorychain）。ETC由若干个氢和电子传递体按氧化还原电位高低顺序排列而成，相当于一段由有机物分子连接而成的“生物导线”，电子在该导线上流动，产生ATP。组成ETC的成员主要有醌及醌衍生物、细胞色素、铁硫蛋白及黄素蛋白4类化合物。

2.氧化磷酸化（OxidatirePhosphorylation）——需氧二、微生物的产能代谢

（一）化能异养微生物的生物氧化

1、发酵发酵(fermentation)是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。在发酵条件下有机化合物只是部分地被氧化，因此，只释放出一小部分的能量。发酵过程的氧化是与有机物的还原耦联在一起的。被还原的有机物来自于初始发酵的分解代谢，即不需要外界提供电子受体。发酵的种类有很多，其底物有碳水化合物、有机酸、氨基酸等，其中以微生物发酵葡萄糖最为重要。葡萄糖是异养微生物的主要碳源和能源，可直接进入糖代谢途径被降解成小分子物质——丙酮酸。主要分为四种途径：（1）EMP途径：糖酵解途径（2）HMP途径：戊糖磷酸途径（3）ED途径：2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）途径（4）PK途径：磷酸解酮酶途径（1）EMP途径主要生理功能是：1、提供ATP和NADH2、中间产物又可提供微生物合成代谢的碳骨架3、可逆转合成多糖无氧条件下，该途径产能效率很低，但多种中间代谢物不仅可为合成反应提供原材料，而且起链接许多有关代谢途径的作用，可用于多种发酵产品的生产。（2）HMP途径

从葡萄糖-6-P开始，即单磷酸己糖基础上开始降解，故亦称为单磷酸己糖途径，磷酸戊糖支路（HMP途径中3-P-甘油醛可以进入EMP途径）。HMP途径的总反应可用下图表示：戊糖磷酸途径的概况一般认为HMP途径不是产能途径，而是为生物合成提供大量的还原力NADPH和中间代谢产物，如核酮糖-5-P是合成核酸、某些辅酶及组氨酸的原料；NADPH是合成脂肪酸、类固醇和谷氨酸的供氢体。另外，核酮糖-5-P还可以转化为核酮糖-1,5-二磷酸，在羧化酶作用下固定CO2，对于光能自养菌、化能自养菌具有重要意义。HMP途径是戊糖代谢的主要途径，其生理意义：①为核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖-磷酸；②产生大量的NADPH，一方面参与脂肪酸、固醇等细胞物质的合成，另一方面可通过呼吸链产生大量的能量；③四碳糖（赤藓糖）可用于芳香族氨基酸的合成；④在反应中存在3~7碳糖，使具有该途径的微生物的碳源谱更广泛；⑤通过该途径可产生许多发酵产物，如核苷酸、氨基酸、辅酶、乳酸等。单独HMP途径较少，一般与EMP途径同存（3）ED途径

ED途径是1952年在研究嗜糖假单胞菌（PseudomonasSaccharophila）时发现的。在ED途径中，葡萄糖-6-P首先脱氢产生6-P-葡萄糖酸，接着在脱水酶和醛缩酶的作用下，产生甘油醛-3-P和丙酮酸，然后甘油醛-3-P进入EMP途径转变成丙酮酸。1分子葡萄糖经ED途径最后生成2分子丙酮酸，1分子ATP，1分子NADPH和NADH。ED途径可不依赖于EMP、HMP途径而单独存在，但对于靠底物水平磷酸化类的ATP的厌养菌而言，ED途径不如EMP途径经济。ED途径是少数EMP途径不完整的细菌例如假单胞菌和发酵单胞菌等所特有的利用葡萄糖的替代途径，包括铜绿、荧光假单胞菌，根瘤菌，固氮菌，农杆菌，运动发酵假单胞菌等。其特点是利用葡萄糖的反应步骤简单，产能效率低（1分子葡萄糖仅产1分子ATP，仅为EMP途径之半），反应中有一个6碳的关键中间代谢物——KDPG。由于ED途径可与EMP途径、HMP途径和TCA循环等各种代谢途径相连接，因此可以相互协调，以满足微生物对能量、还原力和不同中间代谢物的需要。在不同的微生物中，EMP、HMP和ED途径在己糖分解代谢中的重要性是有明显差别的。在微生物细胞中，有的同时存在多条途径来降解葡萄糖，有的只有一种。在某一具体条件下，拥有多条途径的某种微生物究竟经何种途径代谢，对发酵产物影响很大。（4）磷酸解酮酶途径

磷酸解酮酶途径是明串珠菌在进行异型乳酸发酵过程中分解己糖和戊糖的途径。没有EMP、HMP、ED途径的细菌通过PK途径分解葡萄糖，产物有乙酸、乳酸等。该途径的特征性酶是磷酸解酮酶。根据解酮酶不同：具有磷酸戊糖解酮酶的称PK途径，肠膜明串珠菌、番茄乳杆菌、甘露醇乳杆菌、短杆乳杆菌；具有磷酸己糖解酮酶的叫HK途径，双歧杆菌。在无氧条件下，以葡萄糖分解过程中形成的各种中间产物作为受体来接受NADH+H+和NADPH+H+的氢，于是产生了各种各样的发酵产物。由EMP途径中丙酮酸出发的发酵pH小于7.5（一般控制在3.5—4.5）乙醇发酵特点：发酵基质氧化不彻底，发酵结果仍有有机物；酶体系不完全，只有脱氢酶，没有氧化酶；产生能量少。②通过ED途径进行的乙醇发酵（细菌的乙醇发酵）参与微生物：运动发酵假单胞菌同型乳酸发酵：发酵产物只有乳酸，产生2分子ATP；异型乳酸发酵（通过HMP途径或PK途径）：发酵产物除乳酸外还有乙醇与CO2。表同型乳酸发酵与异型乳酸发酵的比较肠杆菌属（产气杆菌）在发酵葡萄糖时，只有一小部分按混合酸发酵的类型进行外，大部分丙酮酸先通过两个分子的缩合成为乙酰乳酸，再脱羧成为3-羟基丁酮，然后再还原为2，3-丁二醇。2、呼吸作用

微生物在降解底物过程中，将释放出电子传给NAD（P）+、FAD或FMN等电子载体，再经电子传递系统传给外源电子受体，从而生成水或其它还原型产物并释放出能量的过程称为呼吸作用。呼吸作用与发酵作用的根本区别在于：电子载体不是将电子直接传递给底物降解的中间产物，而是交给电子传递系统，逐步释放出能量后再交给最终电子受体。其中，以分子氧作为最终电子受体的称为有氧呼吸（aerobicrespiration），以氧化型化合物作为最终电子受体的称为无氧呼吸（anaerobicrespiration）。许多不能被发酵的有机化合物能够通过呼吸作用被分解，是因为在进行呼吸作用的生物电子传递系统中发生了NADH的再氧化和ATP的生成。因此，只要生物体内有一种能将电子从该化合物转移给NAD+的酶存在，而且该化合物的氧化水平低于CO2即可。能通过呼吸作用进行分解的有机物包括某些碳水化合物、脂肪酸、许多醇类。但对人造化合物，如PVC、PP等，微生物的呼吸作用具有显著抗性，可在环境中积累，造成有害的生态影响。

（1）有氧呼吸根据原核生物与真核生物不同，葡萄糖完全氧化总共可获得30或32个ATP。（2）无氧呼吸

某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下进行无氧呼吸，如铜绿假单胞、地衣芽孢杆菌等。无氧呼吸的最终电子受体不是氧，而是像NO3-、NO2-、SO42-、S2O32-、CO2等这类外源受体。无氧呼吸也需要细胞色素等电子传递体，并在能量分级释放过程中伴有磷酸化作用，也能产生较多的能量用于生命活动。但由于部分能量随电子转移传给最终电子受体，所以生成的能量不如有氧呼吸产生的多。

（二）化能自养微生物（以无机物CO2为唯一或主要碳源）的生物氧化

化能自养菌是一类从无机物的氧化中得到能量(ATP)和还原力(NADH2或NADPH2)，再通过卡尔文循环同化CO2的微生物。专性化能自养菌不吸收利用有机物，故不能像异养细菌通过糖酵解和TCA产能。研究证明，某些专性自养菌缺乏一些关键酶，它们的EMP、ED不完全，TCA也存在缺陷：缺乏由TCA中间产物C6或C5产生C4化合物的机制。尽管如此，这些菌却有HMP途径，能沟通糖类进入TCA，并像厌氧微生物那样，能通过有缺陷的TCA获得生物合成所需中间产物。专性化能自养菌氧化无机物时，将产生的电子通过ETC传给氧，其产能过程需要氧，故所有专性化能自养菌都是好氧的。（二）化能自养微生物的能量代谢一些微生物可以从氧化无机物获得能量，同化合成细胞物质，这类细菌称为化能自养微生物。它们在无机能源氧化过程中通过氧化磷酸化产生ATP。化能自养菌的分类和一般特征1、硝化细菌的能量代谢氨氧化为硝酸的过程可分为两个阶段，先由亚硝化细菌将氨氧化为亚硝酸，再由硝化细菌将亚硝酸氧化为硝酸。由氨氧化为硝酸是通过这两类细菌依次进行的。硝化细菌都是一些专性好氧的革兰氏阳性菌，以分子氧为最终电子受体，且大多数是专性无机营养型。2、硫细菌的能量代谢硫杆菌能够利用一种或多种还原态或部分还原态的硫化合物（包括硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、多硫酸盐和亚硫酸盐）作能源。H2S首先被氧化成元素硫，随之被硫氧化酶和细胞色素系统氧化成亚硫酸盐，放出的电子在传递过程中可以偶联产生4个ATP。亚硫酸盐的氧化可分为两条途径，一是直接氧化成SO42-的途径，由亚硫酸盐-细胞色素C还原酶和末端细胞色素系统催化，产生1个ATP；二是经磷酸腺苷硫酸的氧化途径，每氧化1分子SO42-产生2.5个ATP。（三）光能自养菌的能量代谢光能微生物可从阳光中获取能量，通过光合磷酸化产能，即能将光能转变成ATP形式的化学能。光能转变为化学能的过程——光合磷酸化（Photophosphorylation）当一个叶绿素分子吸收光量子时，叶绿素性质上即被激活，导致叶绿素（或细菌叶绿素）释放一个电子而被氧化，释放出的电子在电子传递系统中的传递过程中逐步释放能量，这就是光合磷酸化的基本动力。1、循环（环式）光合磷酸化2、非循环（非环式）光合磷酸化

（1）依赖于菌绿素的光合作用——循环光合磷酸化（cyclic-photophosphorylation）一种存在于厌氧光合细菌中的利用光能产生ATP的磷酸化反应，由于它是一种在光驱动下通过电子的循环式传递而完成的磷酸化，称循环光合磷酸化。这类细菌包括紫色硫细菌/非硫细菌、绿色硫细菌/非硫细菌。其特点是：①在光能的驱动下，电子从菌绿素分子上逐出后，通过类似呼吸链的循环，又回到菌绿素，其间产生了ATP；②产物只有ATP，无NADP（H）；③还原力来自H2S等的无机氢供体；④不产生氧。ATP（2）依赖于叶绿素的光合作用——

非循环光合磷酸化（noncyclicphotophosphorylation）这是各种绿色植物、藻类和蓝细菌所共有的利用光能产生ATP的磷酸化反应。其特点是：①电子的传递途径属非循环式的；②在有氧条件下进行；③有两个光合系统，其中的色素系统Ⅰ（含叶绿素a）可以利用红光，色素系统Ⅱ（含叶绿素b）可利用蓝光；④反应中同时有ATP（产自系统Ⅱ）、还原力[H]（产自系统Ⅰ）和O2产生；⑤还原力NADPH中的[H]是来自H2O分子光解后的H+和e-。（3）两种光合作用的异同点比较三、微生物的耗能代谢

微生物通过发酵、呼吸和光合磷酸化获得能量。所得能量或被细胞直接利用，或者形成ATP等高能化合物，或者使细胞膜处于充能状态(即建立能化膜)。能化膜贮存的能量可用于细胞运动、物质运输，也可以通过驱动ATP酶合成ATP。微生物通过不同途径合成的ATP主要用于细胞物质与代谢产物的合成，其余部分用于维持生命、生物发光或以生物热放出。合成耗能：物质合成消耗的能量包括合成原料进入细胞时主动运输、单体合成、大分子细胞物质合成及代谢产物合成消耗的总能量。主动运输耗能细胞运动：大多数可运动的原核生物是利用鞭毛运动的。在真核微生物中，鞭毛和纤毛均具有ATP酶，水解ATP产生自由能，称为运动所需的动力。发光：在海洋和淡水水体中，有一些细菌能发光。在一定条件下，发光细菌能将细胞内贮存的化学能转化为光能。目前国内常用的3种发光细菌为：明亮发光杆菌、费氏弧菌、青海弧菌。（一）合成代谢与分解代谢的关系

对糖类、氨基酸、脂肪酸、嘌呤、嘧啶等主要细胞成分而言，合成代谢和分解代谢存在共同的中间代谢物。例如由分解代谢产生的丙酮酸、乙酰CoA、草酰乙酸、3-P甘油醛等化合物亦可作为合成反应的起始物。（1）生物合成途径中一个分子的生物合成途径与它的分解代谢途径通常是不同的，其中可能有相同的步骤，但导向一个分子的合成途径与从该分子开始的降解途径间至少有一个酶促反应步骤是不同的。（2）需能的生物合成途径与产能的ATP分解反应相偶联，因而生物合成方向是不可逆的。（3）调节生物合成的反应与相当的分解代谢途径的调节机制无关，因为控制分解代谢途径速率的调节酶，并不参与生物合成途径。生物合成途径主要是被它们的末端产物浓度所调节。（amphibolicpathway）1、①在两用代谢途径中，合成途径并非分解途径的完全逆转，即催化两个方向中的同一反应并不是总是用同一种酶来进行的。例如，葡萄糖合成中，有两个酶与分解代谢时不同，即由果糖二磷酸酶（而不是磷酸果糖激酶）来催化果糖-1，6-二磷酸至果糖-6-磷酸的反应，由葡萄糖-6-磷酸酶（而不是己糖激酶）来催化葡萄糖-6-磷酸至葡萄糖的反应。②在真核生物中，合成代谢和分解代谢一般在细胞的不同区域中分隔进行，即合成代谢一般在细胞质中进行，而分解代谢则多在线粒体和微粒体中进行，这就有利于两者可同时有条不紊地运转。2、代谢回补顺序（anapleroticsequence）指能补充两用代谢途径中因合成代谢而消耗的中间代谢产物的那些反应。与EMP途径和TCA循环有关的回补顺序约有10条。主要围绕EMP途径中的PEP和TCA循环中的OA这两种关键性中间代谢物来进行。丙酮酸PEP（二）微生物独特合成代谢途径1、自养微生物的CO2固定2、生物固氮3、微生物结构大分子——肽聚糖的合成4、微生物次级代谢物的合成1、CO2固定CO2是自养微生物的唯一碳源，异养微生物也能利用CO2作为辅助的碳源。将空气的CO2同化成细胞物质过程，称为CO2的固定作用。自养微生物将CO2加在一个特殊的受体上，经过循环反应，使之合成糖并重新生成该受体。在异养微生物中CO2被固定在某种有机酸上。因此异养微生物即使能同化CO2，最终却必须靠吸收有机碳化合物生存。自养微生物同化CO2所需的能量来自光能或无机物氧化所得的化学能，固定CO2的途径主要有以下三条：

（1）卡尔文循环（Calvincycle）

化能自养微生物和大部分光合细菌中

（2）逆向TCA循环（reverseTCAcycle）

在光合细菌、绿硫细菌中发现此途径

每循环一次可固定4分子CO2，合成1分子草酸乙酰，消耗3分子ATP，两分子NAD（P）H和一分子FADH2。

（3）羟基丙酸途径

（hydroxypropionatepathway）2、生物固氮

生物固氮是指分子氮通过固氮微生物固氮酶系的催化而形成氨的过程。这是一种极其温和的生物化学反应，它比人类发明的利用铁催化剂、在高温（约300℃）、高压（约300个大气压）下的化学固氮要优越得多。固氮微生物有80余属，全部为原核生物(包括古生菌），主要包括细菌、放线菌和蓝细菌。可分为3类：自生固氮微生物、共生固氮微生物、联合固氮微生物。自生固氮菌：独立进行固氮，但并不将氨释放到环境中，而是合成氨基酸；固氮效率较低。⑴固氮微生物共生固氮菌：与其他生物形成共生体，在共生体内进行固氮；将固氮产物氨，通过根瘤细胞酶系统的作用，及时运送给植物体各部，直接为共生体提供氮源。其固氮效率比自生固氮体系高得多。联合固氮菌：必须生活在植物根际、叶面或动物肠道等处才能进行固氮的微生物。联合固氮作用是固氮微生物与植物之间存在的一种简单共生现象。不形成根瘤，但有较强的专一性，固氮效率比自生条件下高。⑵固氮机制生物固氮反应的6个条件：固氮反应的总式为：⑶肽聚糖的合成⑷次生代谢物的合成合成途径：

糖代谢延伸途径；

莽草酸延伸途径；

氨基酸延伸途径；

乙酸延伸途径复习题1、名称解释：生物氧化、有氧呼吸、无氧呼吸、发酵、电子传递链（呼吸链）、光合磷酸化（循环/非循环）、生物固氮、自生/共生/联合固氮菌2、微生物代谢的特点是什么？3、什么是发酵？什么是呼吸？两者有什么主要区别？4、葡萄糖降解主要有几条途径？5、试述同型乳酸发酵与异型乳酸发酵之间的区别。6、化能自养菌的能量代谢有什么特点？7、试述细菌固氮作用机理和必要条件。8、在化能异养微生物的生物氧化中，底物脱氢和产能途径主要有哪几条？9、试从狭义和广义两方面来说明发酵的概念。第二章微生物代谢的调节机制代谢控制发酵课程微生物的代谢错综复杂，参与代谢的物质多种多样，即使同一物质也会有不同的代谢途径，而且各种物质的代谢之间存在着复杂的相互联系和相互影响。在长期进化过程中，微生物建立了一套严密、精确、灵敏的代谢调节体系，能严格控制代谢活动。微生物的代谢调节具有多系统、多层次的特点。本章主要讨论对酶的调节。微生物可以按照适应环境的需要调节酶的表达（即酶蛋白的合成）及调节酶的活性（即酶的激活或抑制）。第一节酶合成的调节通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。在基因转录水平上进行，对代谢活动的调节是间接的，也是缓慢的。优点：通过阻止酶的过量合成，能够节约生物合成的原料和能量。酶合成的调节类型：酶的诱导、酶的阻遏。一、酶的诱导enzymeinduction按照酶合成与环境影响的不同关系，分为两大类：组成酶Structuralenzymes：细胞固有的酶，其合成与环境无关，在菌体内的含量相对稳定，如EMP有关的酶；诱导酶Inducibleenzyme，只在环境中存在诱导剂时才开始合成，一旦环境中没有了诱导剂，合成就终止，如乳糖代谢有关的β-半乳糖苷酶。该过程称为酶的诱导。诱导酶与组成酶在本质上是相同的，区别在于酶合成体系受控制的程度不同。在微生物育种中，常采取诱变等手段使诱导酶转化成组成酶，以利于大量积累所需的代谢产物。诱导的生理作用是可以保证能量与氨基酸不浪费，不把它们用于合成那些暂时无用的酶上，只有在需要时细胞才迅速合成它们。酶的诱导合成又可分为两种：同时诱导：即当诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代谢途径中。例如，将乳糖加入到E.coli培养基中后，可同时诱导出β-半乳糖苷透性酶、β-半乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成。顺序诱导：即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。几个术语诱导作用：培养基中某种基质与微生物接触而增加（诱导）细胞中其相应酶的合成速率。诱导酶：只有在其底物，即有诱导物存在时才被合成的酶。诱导物（inducer）：能引起诱导作用的化合物，可以是底物，也可以是底物的衍生物，甚至是产物。安慰诱导物（gratuitors）：酶底物的结构类似物常是出色的诱导物，但它们不能作为底物被酶转化。1.1操纵子学说——转录水平调节Monod和Jacob（1961）提出了操纵子（Operon）学说用于解释酶的诱导机制。大肠杆菌乳糖操纵子是第一个被发现的操纵子。所谓操纵子（元）是指结构上、功能上协同作用的相关基因组成的一个片段（区域）。操纵子假说认为：编码一系列功能相关的酶的基因在染色体中紧密排列在一起，且它们的表达与关闭是通过同一控制点协同进行的。每个操纵子（元）至少由4个基因（部分）组成：（1）调节基因（Regulatorygene)：编码组成型调节蛋白的基因；（2）操纵基因（Operatorgene）：位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能与阻遏物（一种调节蛋白）结合，以此来决定结构基因的转录能否进行；（3）结构基因（Structuralgene）：决定某一多肽的DNA模板，可根据其上的碱基顺序转录出对应的mRNA，再通过核糖体翻译出相应的酶蛋白；（4）启动基因（Promotergene）：能被依赖于DNA的RNA聚合酶所识别的碱基顺序，即使RNA聚合酶的结合部位，也是转录的起始点。（1）调节基因（Regulatorygene)它能编码调节（阻遏）蛋白，是一类变构蛋白，有2个特殊位点，一可与操纵基因结合，另一可与效应物结合，并发生变构作用，相应的提高或降低与操纵基因的结合能力。现发现有两种调节蛋白：

1.负作用调节蛋白——在没有诱导物时能与操纵基因结合，阻止RNA多聚酶接近启动基因或操纵基因，也称为阻遏物（repressor）。2.正作用调节蛋白——与启动子或启动子附近的DNA结合，能起增强RNA多聚酶与该启动子结合的效应。此种调节蛋白也称为激活因子（actiration）。（2）操纵基因（Operatorgene）

它能控制决定蛋白质（酶）的氨基酸顺序的一整套结构基因的转录，而操纵基因可受调节基因产生的阻遏物所阻遏，许多情况下，单个操纵基因可以控制一个或多个结构基因。

（3）结构基因（Structuralgene）

是指在操纵基因邻近（一般在下游处）存在一个或多个基因，它编码不起调控转录作用的蛋白质，如酶、膜蛋白和核糖体等。一部分结构基因的mRNA合成速度精确地被控制，但许多结构基因以一种（或多或少）不变的速度持续地转录DNA上的遗传信息，生成相应的mRNA进而转译成特定的酶（蛋白质）。（4）启动基因（Promotergene）

启动子（基因）含有两个和RNA聚合酶结合的顺序，一个集中在RNA聚合酶起始位置前约10个碱基对，另一个则集中在这个位置前35个碱基对，当RNA聚合酶与启动子接触并结合上去，mRNA合成即开始。如阻遏物（阻遏调节蛋白）与操纵基因结合，则RNA聚合酶就不能和操纵基因结合，不能向前移动，也就不能转录出互补于结构基因的DNA顺序的mRNA，也就没有酶的生成。但在E.coli中启动子必须经过cAMP受体蛋白复合物的激活后，才能启动。

这些基因形成整套调节控制机制，才能使生命系统在功能上有序、有效及开放。

1.2乳糖操纵子（lacoperon）——

酶合成的负调控诱导调控机制酶合成的正调节诱导——大肠杆菌的麦芽糖操纵子1.3阿拉伯糖操纵子（arabinoseoperon）一、Ara操纵子模型1、Ara操纵子的结构基因在葡萄糖缺乏时，阿拉伯糖是另一个可以为大肠杆菌提供碳源的五碳糖，在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要3个基因。araB基因编码核酮糖激酶；araA基因编码L-阿拉伯糖异构酶；araD基因编码L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶以上3种酶能将Ara分解为大肠杆菌能利用的木酮糖。2、Ara操纵子的结构与araB、araA和araD这3个结构基因相邻的是一个复合启动子区和一个调节基因C，由调节基因C合成的AraC蛋白是一个自我调节蛋白（autoregulatedprotein），它既是ara操纵子的正调节蛋白，又是负调节蛋白。复合启动子区主要有：PBAD区：AraBAD启动子区AraC位点：C蛋白·阿拉伯糖复合物与操纵子结合区-280区：C蛋白与操纵子结合区二、AraC蛋白的正、负调节作用1、AraC蛋白的正调节作用正调节蛋白是激活蛋白，它存在时，结构基因表达。在阿拉伯糖存在时，AraC蛋白与其形成C蛋白·阿拉伯糖复合物，复合物与启动子区的AraC位点结合，激活PBAD，活化RNA聚合酶，使结构基因mRNA正常转录，产生上述3种酶，完成调控。2、AraC蛋白的负调节作用没有阿拉伯糖时，AraC蛋白同时与AraC位点及远距离的-280区结合，造成DNA链的扭曲，不能起始mRNA的转录。酶诱导物的种类：可分3类胰蛋白酶1.4诱导调节的克服

只有需要时才合成所需的酶是微生物应有的、正常的调节机制。如果要使所需要的诱导酶大量生产，可采用诱变方法，借强力因素诱变引起的突变，消除诱导酶，跨越必需依赖诱导物这种障碍。如突变不是发生在结构基因上，而是发生在调节基因或操纵基因上，从而导致调节基因编码的阻遏物（阻遏蛋白）无活性，或操纵基因对活性阻遏物的亲和力衰退，则无需诱导物便能产生诱导酶。这种突变作用称为调节性或组成型突变。具有这种特性的菌株称为组成型突变株。组成型突变株的富集方法

1、在诱导物为限制性基质的恒化器中筛选恒化器：一种微生物连续培养器。它以恒定的速度流出培养液，使容器中的微生物生长繁殖始终低于最快生长速度。这种容器反映的是培养基的化学环境恒定。一亲株经诱变的群体，生长在含有很低浓度的诱导物的恒化器中，有利于不需诱导物的组成型突变株的生长。那些由于诱导物浓度很低而生长缓慢的亲株被恒化器逐渐淘汰。恒化器起到一种富集组成型突变株的作用。如大肠杆菌在低浓度乳糖的恒化器中生长，就可以筛选出没有诱导物存在也能生产β-半乳糖苷酶的组成型突变株。2、将菌株轮番在有、无诱导物的培养基中培养在第一个生长周期在含葡萄糖的培养基中极少量的组成型突变株与占绝对优势的亲株将以同样的速率生长。然后，将此混合培养物移种到乳糖为唯一碳源的培养基中，有利于突变株的生长；未突变的亲株需诱导半乳糖苷酶的合成，经较长的停滞期才开始生长。每次移种到含有葡萄糖的培养基后会使亲株的β-半乳糖苷酶合成立即停止。再移种到含乳糖的培养基中亲株又需经一段停滞期后才能开始生长，因此反复交替上述培养过程，最终会使组成型突变株占优势。3.使用诱导性能很差的基质将经诱变的群体生长在一种能作为碳源，不能作为诱导物或其诱导性能很差的基质上，可筛选出组成型突变株。如，用苯-β-半乳糖苷与2-硝基苯-α-L-阿拉伯糖苷可筛选出大肠杆菌组成型的β-半乳糖苷酶的突变株。4.使用阻碍诱导作用的抑制剂有些化合物会阻扰酶的诱导作用。如，氰乙酰胺抑制绿脓杆菌酰胺酶的诱导合成；2-硝基苯-β-墨角藻糖苷抑制大肠杆菌诱导β-半乳糖苷酶的合成。让细胞生长在含有诱导物和诱导抑制剂的培养基中生长，只有那些不需要诱导物的突变株才能生长。

5.提高筛选效率的方法诱变后的菌群中组成突变株一般只占10-9-10-6个，经上述的方法富集后数量可提高103倍，那么它们在菌群中的相对数量提高到10-6-10-3个，要从一千个菌中找出1个突变株也不是轻而易举的事。如何将少数的组成型突变株在琼脂培养基平板上显形再提高筛选效率呢？要使少数的组成型突变株在琼脂培养基上显形，可采用下面的方法。要筛选β-半乳糖苷酶组成型突变株，可通过富集过的培养物铺在以甘油为碳源的琼脂平板培养基上，待菌落长成后，在平板上喷洒邻硝基酚-β-半乳糖苷，在没有诱导物下，只有组成型突变株能产生β-半乳糖苷酶，能将邻硝基酚-β-半乳糖苷水解，生成黄色的邻硝基酚。在众多白色亲株菌落中，出现一个或数个黄色所需菌落很容易察觉。二、酶的阻遏在微生物的代谢过程中，当代谢途径中某末端产物过量时，可通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。阻遏作用有利于生物体节省有限的养料和能量。阻遏的类型主要有末端代谢产物阻遏（色氨酸操纵子）和分解代谢产物阻遏。2.1末端代谢产物阻遏

（end-productrepression）指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。对直线式反应途径来说，末端产物阻遏的情况较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合成受阻遏，例如精氨酸的生物合成途径。对分支代谢途径来说，情况就较复杂。每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”受所有分支途径末端产物的阻遏，此即称多价阻遏作用（multivalentrepression）。也就是说，任何单独一种末端产物的存在，都没有影响，只有当所有末端产物都同时存在时，才能发挥出阻遏功能。典型的例子——芳香族氨基酸、天冬氨酸族和丙酮酸族氨基酸的生物合成中的反馈阻遏。末端产物阻遏在代谢调节中有着重要的作用，它可保证细胞内各种物质维持适当的浓度。有些操纵子编码的酶参与降解化合物获得分解代谢产物和能量以构成细胞生长所需的其它分子，称为降解操纵子；另一些操纵子编码的酶催化合成细胞所需的化合物，如核苷酸、氨基酸、维生素等，这些操纵子成为合成操纵子。生物合成操纵子也受阻遏物的负调控。能与阻遏物蛋白结合并使其结合于操纵基因的效应物成为辅阻遏物；调节基因编码的阻遏物（蛋白）不结合辅阻遏物就没有阻遏活性，没有阻遏活性的阻遏物（蛋白）称脱阻遏物（蛋白），目前统称为阻遏物蛋白，一旦阻遏物蛋白与辅阻遏物结合，就能结合到操纵基因上，这时就称它为阻遏物。色氨酸操纵子（Tryptophaneoperon）氨基酸的合成也是由操纵子调节的，其基因表达一般都是可阻遏调节。1、色氨酸操纵子的结构色氨酸的合成分5步完成，每个环节需要一种酶，而且编码这5种酶的基因是紧密连锁在一起的，即色氨酸操纵子的结构基因是由这5个基因组成的。TrpE基因编码邻氨基苯甲酸合成酶；TrpD基因编码邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶;TrpC基因编码邻氨基苯甲酸异构酶；TrpB基因编码色氨酸合成酶；TrpA基因编码吲哚甘油-3-磷酸合成酶。2、色氨酸操纵子的调节基因色氨酸操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远，其基因产物被称为辅阻遏蛋白。Trp操纵子的转录调控除了阻遏系统外，还存在弱化系统，使色氨酸的合成达到微细水平调控。3、Trp操纵子的阻遏状态培养基中色氨酸浓度高时，trpR基因的产物——辅阻遏蛋白+色氨酸→有活性的阻遏物→与trp操纵基因结合→阻止结构基因表达4、Trp操纵子的激活状态培养基中色氨酸浓度低时，trpR基因的产物——辅阻遏蛋白不能与trp操纵基因结合→有活性的操作区→结构基因能够表达在没有末端产物的情况下，阻遏蛋白不能与辅阻遏物（如色氨酸）结合成完全阻遏物，因此操纵基因的“开关”是打开的，这时转录、翻译可正常进行，诱导合成酶大量转录翻译合成；反之，阻遏蛋白可与辅阻遏物结合成一个有活性的完全阻遏物，它与操纵基因相结合，使转录的“开关”关闭，从而无法进行转录和转译。弱化作用（attenuation）

——次级基因表达调控机制随着对trp的深入研究，发现有些现象与以阻遏作为唯一调节机制的观点不相一致。在缺乏色氨酸的状态下，trp的转录速率是在有色氨酸存在的状态下的600倍。但阻遏物失活的突变不能完全消除色氨酸对trpoperon表达的影响，没有阻遏物时，在培养基中含或不含色氨酸的条件下观察到转录速度相差8-10倍。这种色氨酸操纵子表达产物的减少是由于弱化作用(attenuation)所造成的，即色氨酸操纵子在第二水平上的调控。弱化机制的加入使基因表达调控达到更高一级的水平。在第一个基因(trpE)的前面5‘端有一个长162bp的序列，称为前导序列(leadersequence)或前导区(leaderregion)。当此序列发生部分缺失或突变时trp基因表达可提高6000倍。这个前导区称为弱化区，所表达出来的前导肽称为弱化子(attenuator)。弱化子实际上是一个转录暂停信号。弱化作用就是通过一个位于mRNA前导序列末端的位点控制转录终止来实现的，只有当负责搬运Trp的tRNA-Trp存在时才会发生这种操纵子转录的提早终止(prematuretermination)。当发生这种提早终止(或叫弱化作用)的时候，RNA聚合酶往往不能通过弱化子序列，而只产生一个140bp左右的核苷酸片段。弱化的作用的调控实质是以翻译手段来控制基因的转录。3∶4茎-环（发夹）是不依赖转录因子终止信号的一部份，是一段富含G/C的回文序列，可以形成发夹结构，当这种结构形成时，使得RNA聚合酶终止转录。阻遏作用和弱化作用的区别与协调

细菌通过弱化作用辅助了阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始了的转录，则只能通过弱化作用使它中途停顿下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少，而弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA，它通过前导肽的翻译来控制转录的进行。到目前为止，已在大肠杆菌中，鼠伤寒沙门氏菌中发现Thr、Ile、Val、Trp、Lea、Phe、His等7种氨基酸合成过程中都存在这种弱化作用机制。在细菌细胞内这两种方式的协同作用，体现了生物体内精密、高效的基因表达调控。那么细菌中为什么需要弱化子调控系统呢？其原因可能是：a.阻遏物从有活性到无活性的转变速度极低，需要有一个能更快地做出反应的系统来维持适当氨基酸的水平。b.弱化子系统主要是对外源氨基酸（色氨酸）浓度作出反应。例如：外源氨基酸（色氨酸）浓度很低的信号，虽然足以引起Trp操纵子去阻遏作用。但这个信号还不足以很快引发内源色氨酸的合成。于是在环境下，弱化子就通过抗终止的方法来增加Trp基因表达，从而提高内源色氨酸的浓度。

为什么还要阻遏体系呢？没有阻遏体系，似乎只有弱化作用也可以调节色氨酸酶系的合成。目前认为当有大量外源色氨酸存在时，通过阻遏体系阻止非必须的先导mRNA合成，使合成更加经济。当然His操纵子中，没有阻遏体系，只有弱化子调节。说明弱化子的调节作用是控制转录的终止，控制转录精细，是阻遏调控体系的次级调节。2.2分解代谢物阻遏

（cataboliticrepression）指细胞内同时有两种可利用底物（碳源或氮源）存在时，利用快的底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。这种阻遏不是由于快速利用底物直接作用的结果，而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引起的。也就是在代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象。1942年，Monod将E.coli培养在含乳糖和葡萄糖的培养基上，发现该菌可优先利用葡萄糖，并于葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，这就产生了在两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”。其原因是，葡萄糖的存在阻遏了分解乳糖酶系的合成。这一现象又称葡萄糖效应。后来发现葡萄糖不仅对乳糖降解酶合成阻遏，而且对好几条降解途径的酶系，如山梨糖醇、木糖醇、阿拉伯糖、甘油等途径的酶合成发生阻遏。由于这类现象在其他代谢中（例如铵离子的存在可阻遏微生物对精氨酸的利用等）的普遍存在，1961年Magasanik将其统称为分解代谢物阻遏。这种阻遏对微生物是很有利的，只要有一个容易同化的底物存在，细胞就不必耗费能量去合成效率较低的途径的酶系，而使其代谢作用能更多地用于产生生长所必需的成分，是微生物细胞经济的一个方面。1、cAMP是对酶合成水平的控制——正调节2.2.1分解代谢物阻遏的机制乳糖操纵子的启动基因P包含两个位点：A，RNA聚合酶结合的位点；B，CAP-cAMP复合物结合位点。CAP是降解物基因活化蛋白（又称为cAMP受体蛋白，CRP）。在只含有乳糖的培养环境中，转录开始时，cAMP先与CAP结合生成cAMP-CAP复合物，该复合物能与乳糖操纵子中的启动子的CAP结合位点结合，激活启动基因，进而促进RNA聚合酶与其结合位点的结合，使转录启动（CAP起正调控的作用），所以解除了分解代谢物阻遏。当乳糖与葡萄糖同时存在时，因为分解葡萄糖的酶类属于组成酶，能迅速将葡萄糖降解成中间产物X，X既会阻止ATP环化形成cAMP，同时又促进cAMP分解成AMP，从而降低了cAMP的浓度，继而阻遏与乳糖降解有关的诱导酶合成。只有当葡萄糖耗尽后，cAMP才能回升到正常浓度，操纵子重新开启，开始利用乳糖作为碳源，形成菌体的二次生长。若CAP基因失活的突变株，就不能诱导任何分解代谢物阻遏系统酶的合成，因而只能在易被利用的基质上生长。腺苷酸环化酶丧失的突变株，cAMP水平下降，就不能在受阻遏的碳源（如甘油、乳糖、蔗糖等）上生长，但它和CAP缺陷突变株不同，外源加入cAMP还是有效的。2.2.2葡萄糖对细胞内cAMP水平的调节（1）可能是由于葡萄糖分解过程中的某些中间产物抑制了细胞内cAMP的形成；（2）可能是这种中间产物激活了cAMP的分解。X抑制激活2.2.3分解代谢物阻遏作用的克服一种碳源起分解代谢物阻遏作用的效能取决于它作为碳源的效率，而不是它的化学结构。在一种微生物中起分解代谢物阻遏作用的化合物可能在另一种微生物中不起作用。如，对于大肠杆菌，葡萄糖比琥珀酸更易起分解代谢物阻遏作用，而对恶臭假单胞菌的作用恰好相反。工业生产上，在生产培养基内不使用阻遏性碳源，将有利于对分解代谢物阻遏敏感的酶的生产。例如，采用甘露糖培养荧光假单胞菌纤维素变株，其纤维素酶的产量相当于生长在半乳糖上的1500倍。如果出于经济上的原因，必须使用阻遏性碳源时，可通过过程补糖的办法限制生产菌的糖耗速率，以消除分解代谢物阻遏对酶生产的影响。如给荧光假单胞菌纤维素变株缓慢补糖，可使纤维素酶的产量几乎增加200倍。2.2.4耐分解代谢物阻遏的突变株获得用强力因素诱变与适当的筛选方法可以获得耐分解代谢物阻遏的突变株。这类突变株的葡萄糖利用速率减慢，解除了对单一种或一系列酶合成的阻遏作用。筛选原理是：以一种能引起分解代谢物阻遏的基质作为唯一的氮源，用含有这种氮源的培养基的琼脂平板培养筛选诱变后的菌株。在葡萄糖-脯氨酸琼脂平板上可筛选出耐分解代谢物阻遏的脯氨酸氧化酶的生产菌株（鼠伤寒杆菌突变株）。因脯氨酸氧化酶的合成受葡萄糖的阻遏，野生型亲株不能生长在这样的培养基上，只有耐分解代谢物阻遏的突变株才能从氧化脯氨酸中取得生长所需的氮源。组氨酸降解酶类受葡萄糖的阻遏，而从组氨酸的分解代谢中获得氮源又是菌株生长所必需的。将产气气杆菌连续移植到含有葡萄糖及组氨酸为唯一氮源的培养基上，用于筛选耐分解代谢物阻遏的突变株。因此能在这种培养基上生长的必然是能耐葡萄糖阻遏的突变株。另一方法是轮番让菌株在含有葡萄糖和不含葡萄糖的培养基上生长。小结酶的诱导、分解代谢物阻遏和末端产物阻遏可以同时发生在同一微生物体内。这样，当某些底物存在时微生物体内就会合成诱导酶，几种底物同时存在时，优先利用能被快速或容易代谢的底物；而与代谢较慢的底物有关酶的合成将被阻遏；当末端代谢产物能满足微生物生长需要时，与代谢有关酶的合成又被终止。操纵子学说是从原核微生物代谢调节的研究中建立起来的，对于真核微生物，情况更复杂。酶合成的调节除可发生在上述转录水平，也可能发生在翻译水平。蛋白质翻译水平上的调节是指改变某些氨基酰tRNA的浓度及调节蛋白质的合成速度，高浓度的氨基酰tRNA可阻止肽链的合成。第二节酶活性的调节

——蛋白质水平上的调节通过改变酶分子的活性来调节代谢速度的方式称为酶活性的调节。与酶合成调节方式相比，这种方式更直接，见效快。某些酶的活性受到底物或产物或其结构类似物的影响，称为调节酶（regulatoryenzyme）。这种影响可以是激活或抑制。底物对酶的影响称为前馈，产物对酶的影响称为反馈。酶活性的调节包括酶活性的激活和抑制两个方面。酶的激活指在分解代谢途径中，后面的反应可被较前面的中间产物所促进，例如粪链球菌（Streptococcusfaecalis）的乳酸脱氢酶活性可被果糖-1，6-二磷酸所促进等。这类激活作用主要有两种：前体激活、代谢中间产物的反馈激活。2.1酶的激活1、前体激活：指代谢途径中后面的酶可被途径中较前一个中间产物所促进。粪链球菌的乳酸脱氢酶活性可被果糖-1，6-二磷酸所促进；粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）的异柠檬酸脱氢酶的活性受柠檬酸促进。2、代谢中间产物反馈激活，指代谢中间产物对该代谢途径前面的酶起激活作用。较少见，典型例子：果糖-1，6-二磷酸是磷酸果糖激酶的激活剂。2.2酶活性的抑制——反馈抑制酶活性的抑制主要是反馈抑制（feedbackinhibition），它主要表现在某代谢途径的末端产物（即终产物）过量时，这个产物可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性，促使整个反应过程减慢或停止，从而避免了末端产物的过多累积。反馈抑制具有作用直接、效果快速以及当末端产物浓度降低时又可重新解除等优点。2.2.1反馈抑制的类型1．直线式代谢途径中的反馈抑制2．分支代谢途径中的反馈抑制（1）同工酶调节（2）协同反馈抑制（concertedfeedbackinhibiton）（3）合作反馈抑制（cooperativefeedbackinhibiton）（4）累积反馈抑制（cumulativefeedbackinhibiton）（5）顺序反馈抑制（sequentialfeedbackinhibiton）（6）终产物抑制的补偿性逆转(compensatoryreversalofend-productinhibition)1．直线式代谢途径中的反馈抑制E.coli在合成异亮氨酸时，合成产物过多可抑制途径中第一个酶——苏氨酸脱氨酶的活性，从而使α-酮丁酸及其后一系列中间代谢物都无法合成，最终导致异亮氨酸合成的停止。大肠杆菌中由氨甲酰磷酸和天冬氨酸合成CTP时需要7种酶，当CTP达到一定浓度后，便反馈抑制催化第一个反应的酶，即天冬氨酸转氨甲酰酶。（1）同工酶调节同工酶是指能催化同一生化反应，但结构稍有不同，可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。特点：途径中第一个反应被两个不同的酶所催化，一个酶被H抑制，另一个酶被G抑制。只有当H和G同时过量才能完全阻止A转变为B。（2）协同反馈抑制指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。如多粘芽孢杆菌（Bacilluspolymyxa）、谷氨酸棒杆菌的单一的天门冬氨酸激酶（AK）受终产物Lys和Thr的协同反馈抑制，这种抑制在Lys或Thr单独过量存在时并不会发生。（3）合作反馈抑制又称增效反馈抑制，指两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末端产物大得多的反馈抑制作用。在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP（和IMP）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完全抑制该酶的活性。而二者单独过量时，分别抑制其活性的70%和10%。如乳糖发酵短杆菌的AK受Thr和Lys的增效性抑制，即Thr和Lys中任何一个过量对AK均有抑制作用，Thr和Lys同时存在时，抑制作用加强。（4）累积反馈抑制每一分支途径的末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时，它们的抑制作用是累积的。在各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作用。累积反馈抑制最早在E.coli的谷氨酰胺合成酶调节中发现，该酶受8个最终产物的累积反馈抑制，只有当它们同时存在时，酶活力才被全部抑制。如色氨酸单独存在时，可抑制酶活力的16％，CTP相应为14％，氨基甲酰磷酸为13％，AMP为41％。这4种末端产物同时存在时，酶活力的抑制程度可这样计算：色氨酸先抑制16％，剩下的84％又被CTP抑制掉11.8％（即84％×14％）；留下的72.2％活性中，又被氨基甲酰磷酸抑制掉9.4％（即72.2％×13％），还剩余62.8％；这62.8％再被AMP抑制掉25.8％（即62.8％×41％），最后只剩下原活力的37％。当8个产物同时存在时，酶活力才被全部抑制。（5）顺序反馈抑制这一现象最初是在研究枯草杆菌的芳香族氨基酸生物合成时发现的。当E过多时，可抑制C→D，这时由于C的浓度过高而促使反应向F、G方向进行，结果又造成了另一末端产物G浓度的增加。过量的G抑制了C→F，造成C的浓度进一步增加。过量C又对A→B间的酶发生抑制，从而达到了反馈抑制的效果。枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸的合成途径中分支点中间产物预苯酸和分支酸抑制DAHP合成酶，而Trp、Phe和Tyr则分别抑制各自分途径的第一个酶。（6）终产物抑制的补偿性逆转一个分支途径的终产物（E）能完全抑制共同序列的第一个酶，另一个分支的前体（I）却是同一个酶的激活剂，起到抑制效应的对抗物作用。大肠杆菌中，一个分支的终产物是UMP，另一个分支的终产物是Arg。UMP抑制催化共有反应的氨甲酰磷酸合成酶。鸟氨酸作为另一个分支的前体却能激活这个酶，以防止它被UMP完全抑制。反馈阻遏与反馈抑制的比较2.2.2反馈抑制的机制酶活性调节机制有多种理论解释，主要有:1、酶分子的化学修饰理论——其核心是酶分子结构的改变2、别构（变构）调节理论——其核心是酶分子构象的改变3、缔合与离解等（一）酶的共价修饰共价修饰是酶蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解离，使其活性改变（导致调节酶活化或抑制）以控制代谢的速度和方向，这是一种快速、灵敏、高效的细调方式。由共价修饰引起酶活性（有时还涉及调节特性）改变的酶叫共价调节酶。共价修饰作用可分为可逆共价修饰和不可逆共价修饰。

细胞中有些酶存在活性和非活性两种状态，它们可以通过另一种酶的催化作共价修饰而互相转换。例如，磷酸化酶是通过激酶或磷酸酯酶来调节活性的。1、可逆共价修饰由于小化学基团对蛋白质结构进行共价修饰，使酶蛋白在活性（高活性）和非活性（低活性）转变。已知有多种类型的可逆共价修饰蛋白（酶），包括：1.磷酸化/去磷酸化2.乙酰化/去乙酰化3.腺苷酰化/去腺苷酰化4.尿苷酰化/去尿苷酰化5.甲基化/去甲基化6.S-S/SH相互转换等蛋白质共价结合部位,一般为丝氨酸残基的-CH2OH。反应类型共价修饰被修饰的氨基酸残基磷酸化腺苷酰化尿苷酰化Tyr，Ser，Thr，HisTyrTyr甲基化GluS-腺苷-MetS-腺苷酶的可逆共价修饰作用的意义在于：⑴可在短时间内改变酶的活性，有效地控制细胞的生理代谢；⑵这种作用更易为响应环境变化而控制酶的活性。2、不可逆共价修饰典型的例子是酶原激活。这是无活性的酶原被相应的蛋白酶作用，切去一小段肽链而被激活。酶原变成酶是不可逆的。胰蛋白酶原活化是信号放大的一个典型例子，其活化需从N-端除去一个己肽（Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）。少量的肠肽酶可激发大量的胰蛋白酶原转变成胰蛋白酶，这是因为胰蛋白酶催化其自身的活化。一旦这些胰酶完成其使命后，便被降解而不再恢复为酶原。这种活性的关闭作用是极其重要的。3、酶共价修饰调节的特点

作用方式：酶都具有两种形式即无活性（低活性）和有活性（高活性）。作用本质：酶分子共价键发生了改变，即酶的一级结构发生改变，而别构酶中酶分子只发生非共价键的改变，即构象的改变。作用能耗：所需酶分子比生物合成酶要少，在酶分子发生磷酸化等修饰作用反应中，一般每个亚基只消耗耗1个ATP，比每亚基生物合成所需的ATP少很多。作用效率：共价调节酶的调节信号具有放大效应，其催化效率比别构酶调节要高很多。（二）变构效应（allostericeffect）酶活性调控的实质就是变构酶的变构调节。变构（别构）效应是指一种小分子物质与一种蛋白质分子发生可逆的相互作用，导致这种蛋白质的构象发生改变，从而改变这种蛋白质与第三种分子的相互作用。变构效应是Gerhart与Pardee于1962年研究胞苷三磷酸（CTP）对其自身合成的反馈抑制作用时发现的。变构酶(allostericenzyme)：具有变构效应的酶。有些酶除了活性中心外，还有一个或几个部位，当特异性分子非共价地结合到这些部位时，可改变酶的构象，进而改变酶的活性。酶的这种调节作用称为变构调节，受变构调节的酶称变构酶，这些特异性分子称为效应剂。

1、变构酶的结构和特性

含多个亚基的四级结构的蛋白质（一般为四聚体），亚基的结构和功能可以相同，也可以不同。变构酶含有两个中心，一个是与底物结合的活性中心（也称催化部位或活性部位）；另一个调节中心（也称变构部位）。它们在空间上是分开的，可以在不同的亚基上，也可以在同一亚基的不同部位上。当调节中心（变构部位）与最终产物结合之后就改变了酶分子的构象，从而影响了底物与活性中心的结合。这种结合是可逆的。每个变构酶的分子可以结合一个或多个配体（底物或效应物），理论上结合底物的最大数目与催化中心的数目相等。结合效应物的最大数目应与调节中心的数目相等。2、变构酶活性调节机理（1）Monod-Wyman-Changeux模型（齐变模型，concertedmodel）——MWC模型变构酶存在着两种构象状态，R状态（催化状态或松弛态，利于结合底物）和T状态（抑制状态或紧张态，不利结合底物）。添加配体（包括底物、激活剂或抑制剂）可以使R状态和T状态之间的平衡发生移动，转变对每个亚基都是同步（齐步）发生的。(2)Koshland-Nemethy-Filmer模型（序变模型，sequentialmodel）——KNF模型构象的变化并不是同时发生在所有的亚基上，而是仅发生在结合有配体的亚基上。这个亚基-配体复合体致使邻近亚基间发生相互作用的变化，从而促进或减弱底物与变构酶分子中其他亚基结合的亲和力，并在其影响下促进下一个配体的结合。3、变构酶的动力学性质变构酶的反应动力学不同于普通酶，它不符合米氏动力学方程式。变构酶的反应速度与底物浓度（或变构抑制剂的浓度）的关系曲线呈S型，这表明有协同性。当底物浓度固定时，变构抑制剂浓度与酶反应速度之间的关系也呈S形曲线，这是变构蛋白的基本性质。当底物或效应物浓度极低时，酶反应速度的变化极微小，这是因为效应物浓度极低时，不具有协同性，当效应物浓度超过某个水平（阈值）时酶反应速度急剧增大（减小）。即存在着底物或效应物对反应速度发生影响的阈值。这在代谢控制上具有很大的生理意义。4、变构酶调节的实例

E.coli的天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATC，对嘧啶核苷酸合成的调节起关键酶的作用。它是以构象转变进行反馈抑制的典型例子。ATC催化Asp与氨基甲酰-P之间的转移而合成氨基甲酰天冬氨酸。此酶受末端终产物CTP的反馈抑制，并能为ATP所激活。其酶反应速度与底物Asp浓度的关系呈S形，有协同性。图：底物Asp浓度对ATC受CTP抑制时的影响。S形曲线表明，随Asp浓度的增加，ATC酶与底物的亲和力协同性增大；CTP能抑制ATC酶活性，但不能全部抑制，增加Asp的浓度可以恢复酶的全部活力。可见，CTP与底物是分别与酶结合而不是竞争同一个活性中心；底物浓度饱和而达到的最大反应速度不受抑制剂的影响，当显著提高底物浓度时，看不到抑制。5、变构酶的脱敏作用变构酶经特殊处理后，不丧失酶活性而失去对变构效应物的敏感性，称为脱敏作用（desensitingation）。可通过许多方法：加热处理、0—5℃低温处理、化学试剂（汞盐、对氯汞苯甲酸（PCMB）、尿素等）透析、X射线照射、蛋白酶有限水解、pH的改变等。（1）变构酶解聚利用上述物理、化学等方法处理变构酶后，可使变构酶多聚物解聚导致对效应物脱敏，失去调节功能。解聚后的单体不再相互作用，失去协同性，反应速度与底物浓度之间的关系曲线不再呈S形，而是普通酶的双曲线。（2）基因突变为变构酶编码的结构基因的突变可引起脱敏，如诱变育种获得抗类似物突变株中多发生这种变化，在氨基酸和核苷酸发酵育种上，已作为突破微生物代谢控制的一个重要手段利用。（三）缔合与解离

（Associationanddissociation）能进行这种转变的蛋白质由多个亚基组成。蛋白质活化与钝化是通过组成它的亚单位的缔合与解离实现的。这类互相转变有时是由共价修饰或由若干配基的缔合启动的。2.2.3调节酶特性调节酶（regulatoryenzyme）在多酶体系中对代谢过程起调节作用的酶，一般是反应途径中的第一个酶，或是代谢途径分支点的酶。其催化活性受到严格的调节控制。包括变构酶、同功酶和多功能酶。多功能酶（multifunctionalenzyme），指多肽链上有两个或两个以上催化活性，能够催化两种以上不同反应的酶。酶活力的调控，实质上就是通过调节酶的变构调节来实现的。调节酶一般为变构酶，是具有多亚基四级结构的蛋白质，具有2个活性部位，变构部位和催化部位。调节酶的反应速度与底物浓度（或变构抑制剂浓度）的关系曲线呈S形，有协同性，存在底物或效应物对反应速度发生影响的阈值。调节酶多处于合成代谢的途径上，大多发生在氨基酸和核苷酸合成途径上，而且一般在代谢途径的第一步或处于代谢途径的分支点上，多受终产物的反馈抑制。终产物在结构上与底物无相似性。中间产物不影响调节酶的活力。经特定处理后，可使变构酶解聚，或为变构酶编码的基因发生突变，失去调节功能，但一般不丧失其催化活性。通过调节酶与负效应剂非共价结合而引起的变构作用，对酶活性的控制是一种快速、敏感和高效的细调方式。2.2.4代谢途径的横向调节⑴代谢互锁⑵辅助底物（co-substrate）和终产物对另一个分支途径的调节

⑴代谢互锁（metabolicinterlock）分支途径上游的某个酶（催化G→H反应的酶）受到另一条分支途径的终产物，甚至与本分支途径几乎不相关的代谢中间产物的抑制或激活（X、Y、和D起激活作用，F起抑制作用），使酶的活力受到调节。

代谢互锁是表面完全不相关的两条途径之间的调节。这种作用一般在高浓度下才显示，且为部分抑制。⑵辅助底物（cosubstrate）和终产物对另一个分支途径的调节分支途径的第一个酶，受另一分支途径的辅助底物（D）的抑制和终产物（G）的激活；共同途径的终产物（即分支点C）形成受分支途径的终产物（I）的调节。第三节细胞膜透性调节细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的屏障。细胞从外部环境中吸收营养物质或将细胞内代谢产物分泌至细胞外，都要通过细胞膜。细胞通过对膜透性大小的调节实现对代谢过程的部分调节。1.控制营养物质进入细胞在培养基中加入由速效碳氮源和缓效碳氮源组成的混合碳氮源时，细菌会出现二次生长现象。当速效与缓效碳氮源同时存在时，细胞膜通常不允许缓效碳氮源进入细胞，只有当速效碳氮源耗尽时，细胞才合成运输缓效碳氮源的载体和分解该物质的酶系。控制营养物质进出细胞载体的合成及跨膜运输是细胞进行代谢调节的基本方式之一。2.解除反馈抑制当细胞膜完整时，透性小，细胞内的某代谢产物不能及时分泌到细胞外部，在细胞内不断累积，至其浓度达到一定程度时发生反馈抑制，导致该代谢产物合成减慢或停止。采用人为措施使细胞膜通透性增大，细胞内的代谢产物能及时分泌到细胞外部，不会在细胞内累积到引起反馈抑制的浓度，则该代谢产物的合成就会源源不断地进行，进而在发酵液中累积到较高浓度。例：向培养基中加入青霉素等抗生素，阻止肽聚糖合成，形成残缺破损的细胞壁，也能促进细胞内谷氨酸向细胞外大量分泌，解除反馈抑制。例：加入吐温80等脂肪酸衍生物也能达到增大细胞膜透性的效果。代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用工业发酵的目的就是大量积累人们需要的微生物代谢产物。在正常生理条件下，微生物总是通过其代谢调节系统最经济的吸收利用营养物质合成细胞结构，进行生长和繁殖。它们通常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物。人为打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行，这就是所谓的人工控制。虽然微生物代谢调节的理论目前还有很大的局限性，但它已在微生物育种和发酵工艺的优化中发挥了重要作用。随着代谢理论的不断充实和完善，代谢的人工控制将对发酵工业发挥更加重要的作用。复习题名词解释：操纵子，调节基因，效应物，调节蛋白。什么是同功酶？什么是变构酶？它们在反馈抑制中起着什么作用？什么是诱导酶？酶的诱导有何特点？其意义如何？什么是阻遏？什么是末端产物阻遏？什么是分解代谢物阻遏？反馈抑制的本质是什么？分支代谢途径中存在哪些主要的反馈抑制类型？第三章代谢控制发酵

的基本思想代谢控制发酵课程第一节代谢控制发酵的基本思想代谢控制发酵能否获得成功，目的产物的产量高低与否，取决于微生物细胞自我调节控制机制是否能够被解除和解除的程度。最有效的方法就是选育从遗传角度解除了正常代谢控制机制的微生物突变株。代谢控制发酵的基本思想切断支路代谢解除菌体自身的反馈调节增加前体物的合成去除终产物条件突变株的应用选育不生成副产物的菌株一、切断支路代谢1、营养缺陷型突变株（A-）的应用所谓营养缺陷型就是指原菌株由于发生了基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某种物质的能力，必须在培养中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。由于其在合成途径中某一步骤发生缺陷，致使终产物不能积累，因此，也就遗传性地解除了终产物的反馈调节，使得中间产物或另一分支途径的末端产物得以积累。①无分支途径图谷氨酸棒杆菌鸟氨酸生物合成途径①乙酰谷氨酸合成酶②乙酰谷氨酸激酶③N-乙酰谷氨酸半醛脱氢酶④乙酰鸟氨酸转氨酶⑤乙酰鸟氨酸酶

Arg对①→⑤有反馈调节作用。选育瓜氨酸缺陷突变株（Cit-），亚适量添加瓜氨酸，就会积累大量的鸟氨酸。②分支途径

E、G协同反馈抑制第1个酶的活性和阻遏酶的生成。当菌株失去C→D的能力即成为D或E缺陷型突变株时，解除了E、G对第1个酶的协同反馈调节。当培养基中限量添加E，那么只剩下G对C→F转变的控制，F、G不会过量生成，而使C得以积累。例：利用枯草芽孢杆菌营养缺陷型生产肌苷5－磷酸核糖焦磷酸PRPP谷氨酰胺PRPP转移酶5－磷酸核糖胺腺嘌呤核苷琥珀酸SAMP黄嘌呤核苷酸XMP腺嘌呤核苷酸AMP鸟嘌呤核苷酸GMP5’-IMP肌苷酸肌苷IR肌苷发酵就是通过代谢流的阻塞来消除终产物的反馈调节，以达到中间产物的积累。选用腺嘌呤缺陷型Ade-时，切断了IMP到AMP这条支路代谢，通过在培养基中限量控制腺嘌呤的量，可以解除腺嘌呤系化合物对PRPP转酰胺酶的反馈调节，可以IR得以积累。如果在Ade-基础上再诱变成黄嘌呤缺陷型Xan-或鸟嘌呤缺陷型Gua-，可以切断IMP到GMP这条支路代谢，从而增加IR的积累。③积累另一分支途径的终产物在分支合成途径中，由于存在着多个终产物单独存在时不能对其合成途径的关键酶实现全部反馈抑制或阻遏这一现象，因此，可以利用这种机制选育营养缺陷型菌株，造成一个或两个终产物合成缺陷而使另外的终产物得以积累。通常I、E协同反馈调节途径第一个酶，但菌株丧失C→F的能力，是I、G的双缺陷突变体。若在培养基中亚适量添加I、G，就解除I、E对第一个酶的协同反馈调节，使终产物E大量积累，所以只要选育F或G、I双缺陷型突变株就可以积累E。关键酶天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制苏氨酸缺陷型高丝氨酸缺陷型例：利用高丝氨酸营养缺陷型(Hom-)或苏氨酸营养缺陷型(Thr-)菌株达到赖氨酸的积累2、渗漏突变株（AL）的应用渗漏突变株就是指遗传性障碍不完全的缺陷型。这种突变是使它的某一种酶的活性下降而不是完全丧失，因此，渗漏缺陷型能够少量地合成某一种代谢最终产物，能在基本培养基上进行少量的生长。由于渗漏缺陷型不能合成过量的最终产物，即解除了反馈调节，所以不会造成反馈抑制而影响中间代谢产物的积累。二、解除菌体自身的反馈调节1、选育抗类似物突变株（Ar）结构类似物：在微生物生理学中是指某些与指定代谢中间产物、合成途径的终产物等空间结构相似而代谢性能不同的化合物。判别结构类似物的要点：一是空间结构类似；二是对微生物有致死性或毒性。结构类似物的作用机理结构类似物由于与代谢产物结构相似，所以同样能与阻遏物以及变构酶相结合。可是它们往往不能代替正常的氨基酸而合成蛋白质，也就是说它们在细胞中的浓度不会降低，因此阻遏物与变构酶的结合是不可逆的。这就使得有关的酶不可逆地停止了合成，或是酶的催化作用不可逆地被抑制。抗类似物突变株：在含一定浓度结构类似物的培养基中仍能生长的突变株。选育抗性突变株，因为代谢调节可被遗传性地解除，在发酵时可不再受培养成分的影响，生产较为稳定，不易发生回复突变，因此在发酵生产上被广泛采用。例：精氨酸的生物合成途径及反馈调节精氨酸的合成受其本身的反馈抑制和反馈阻遏，为了积累像精氨酸这样非支路代谢途径的终产物，主要采用抗精氨酸类似物突变株。D-精氨酸抗性精氨酸氧肟酸盐抗性2、酶特性的利用在育种过程中，当找不到有效类似物时，如果目的产物的生物合成途径中某个酶具有底物