免疫学检验技术-免疫原和抗血清的制备

知识目标1.掌握：免疫原和佐剂的概念（重点）。2.熟悉：抗血清制备时免疫动物的选择和免疫方案的制定

。抗血清制备的流程（难点）。3.了解：蛋白质的分离和纯化方法

；佐剂的应用。能力目标1.熟练掌握免疫原的制备方法。2.学会抗血清的制备方法。素质目标细心、耐心、免疫学基本思维教学目标免疫原和佐剂的概念。抗血清制备时免疫动物的选择和免疫方案的制定

。抗血清制备的流程。蛋白质的分离和纯化方法

。佐剂的应用。本章要点目录免疫原的制备一免疫血清的制备二抗原和抗体是免疫学检测中的两大基本因素，抗原的纯化是制备特异性抗体的先决条件，制得的抗体又可用于抗原的纯化和检测。前言第一节免疫原的制备

免疫原（immunogen）就是抗原，是指能够刺激机体产生抗体并能与之发生特异性反应的物质。众多的抗原物质中绝少是单一组分的，所以必须从复杂的物质中提取出目的抗原成分，制成合格的免疫原。一、细胞性免疫原的制备1.绵羊红细胞抗原制备采集新鲜绵羊红细胞注入无菌并带有玻璃珠的三角烧瓶内，充分摇动15分钟后除去纤维蛋白，再以无菌生理盐水洗涤3次，最后配成1×106/ml浓度的细胞悬液，即可应用。

2.细菌抗原的制备细菌抗原有菌体抗原和鞭毛抗原等，多选用典型菌株的液体或固体培养物经集菌后处理。鞭毛抗原需用有动力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛处理，而菌体抗原则需要在100℃加温2～2.5小时后应用。

蛋白质、酶、核酸、细菌毒素等皆为可溶性抗原，这些物质大多来源于人和动物的组织和细胞，要想获得此类抗原，通常要先破碎组织和细胞，再进一步提取和纯化。

二、可溶性抗原的制备及鉴定1.组织匀浆的制备

高速捣碎法研磨法（一）组织和细胞中可溶性抗原的粗提

2.细胞破碎的方法⑴反复冻融法⑵超声破碎法⑶溶菌酶处理法⑷自溶法⑸表面活性剂处理法1.超速离心法2.选择性沉淀法3.凝胶过滤和离子交换层析4.亲和层析5.电泳

（二）可溶性抗原的提纯

1、超速离心法原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗原，极难将某一抗原成分分离出来。应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原物质的分离，如IgM、C1q、甲状腺球蛋白、载脂蛋白A、B等。2、选择性沉淀法原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。常用：盐析沉淀法用硫酸铵等中性盐中和蛋白质表面的电荷及破坏水化膜，使蛋白质沉淀。3、凝胶过滤法凝胶具有三维空间多孔网状结构4、离子交换层析法原理：带离子基团的纤维素或凝胶可吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质因等电点不同所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。梯度洗脱时逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而使血清中的蛋白质分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。5、亲和层析法优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。

纯化抗原的鉴定内容包括含量、分子量、纯度和免疫活性的鉴定等。鉴定方法较多，常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳法、酶联免疫吸附试验、免疫电泳法、双向琼脂扩散试验等。

（三）纯化抗原的鉴定

用化学合成法或基因重组法制备的抗原，称之为人工抗原，包括人工结合抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。三、人工免疫原制备

半抗原不能直接做为免疫原，只有把这些半抗原和大分子物质结合后，才具有免疫原性。这种经过人工修饰的半抗原称之为人工合成抗原，用于偶联半抗原的大分子物质称为载体。

（一）人工合成抗原制备

1.常用的载体⑴蛋白质类⑵多肽聚合物⑶大分子聚合物

2.半抗原与载体的连接半抗原+载体（蛋白、合成载体）=完全抗原物理法或化学法连接3.人工结合免疫原的鉴定要鉴定人工结合免疫原的质量，必须要测定偶联在载体上的半抗原量，常用的测定方法有吸收光谱分析法和核素标记半抗原渗入法。

用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽，即人工合成抗原。

（二）人工合成抗原

将编码免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并与适当载体DNA分子相结合，然后引入受体细胞中（如大肠杆菌或酵母菌）使之表达，能获得免疫原性之融合蛋白，经纯化后可作为抗原，即基因工程抗原。

（三）基因工程抗原四、佐剂为了促进抗体的产生，可在注射抗原的同时，加入一种辅助剂，这种辅助剂称为免疫佐剂（immunoadjuvant）,简称佐剂（adjuvant）。

在进行动物免疫时最常用的佐剂是福氏（Freund）佐剂，根据有无卡介苗又可分为福氏不完全佐剂和福氏完全佐剂。福氏不完全佐剂是由油剂和乳化剂制成，在福氏不完全佐剂中加入卡介苗就成了福氏完全佐剂。

（一）佐剂的种类

福氏佐剂和抗原的比例为1:1。由于福氏佐剂是油剂，加入抗原后要充分混合成乳剂。

混合方法：研磨法搅拌注射器混合法注射器混合法1.改变抗原的物理性状，延长抗原在体内的存留时间，从而有效地刺激免疫系统；2.刺激单核-吞噬细胞系统，增强其抗原提呈能力；3.可加强淋巴细胞的增殖分化，促进其对抗原的处理能力。

（二）佐剂的作用机制第二节免疫血清的制备将抗原以不同途径免疫动物，可从动物血清中分离得到抗体，因而把这类含有抗体的血清称为抗血清或免疫血清。天然抗原常含有多种抗原决定簇，可刺激动物体内多个B细胞克隆针对该抗原的多种抗原决定簇产生不同的抗体，所以抗血清实质上是多克隆抗体（PcAb）。多价抗原多个B细胞克隆（致敏的B细胞）多克隆抗体抗血清的制备流程免疫动物选择免疫方案制定动物采血抗血清分离纯化及鉴定

抗血清的保存

一、免疫动物选择1．抗原来源与免疫动物的种属关系2．动物的个体情况

3．抗原的性质

4．抗血清的用量及要求

二、免疫方案制定

1．免疫原的剂量2．免疫途径

3．免疫时间间隔

次序日序（天）注射途径注射剂量（ml）抗原11多点皮内1.0沙门菌O抗原26静脉0.5沙门菌O抗原311静脉0.5沙门菌O抗原416静脉1.0沙门菌O抗原519静脉2.0沙门菌O抗原伤寒沙门菌O抗原免疫家兔的方案三、动物采血1．颈动脉放血法：最常用的方法2．心脏采血法：此法多用于豚鼠等小动物，技术要求高

3．静脉采血法：可多次进行，所以可收集到的血液量较多

四、抗血清的分离纯化及鉴定采集的血液多采用在室温自然凝固，待凝块收缩后分离血清。前者迅速，但获得血清较少；后者时间长，但获得血清多，而且效价稳定。（一）抗血清的分离1.特异性抗体的纯化

①亲和层析法②吸附剂方法2.IgG类抗体的纯化

①盐析②凝胶过滤③离子交换和亲和层析法（二）抗血清的纯化1.抗体效价的鉴定

一般原则是颗粒性抗原用凝集试验，可溶性抗原用双向琼脂扩散试验。

2.抗体特异性的鉴定

常用双向免疫扩散法进行鉴定。

（三）抗血清的鉴定3.抗体纯度的鉴定

可采用免疫电泳、双向琼脂扩散试验、SDS等方法鉴定。4.抗体亲和力的鉴定

常用ELIS