清华大学毕业学位论文-上转换荧光高分辨率在体成像技术及应用研究

上转换荧光高分辨率在体成像技术及应用研究(申请清华大学工学硕士学位论文)培养单位：医学院学科：生物医学工程研究生：:教授二○一三年五月高分辨率上转换荧光在体成像技术及应用研究黎新ResearchofUpconversionFluorescenceHighResolutioninvivoImagingandItsApplicationThesisSubmittedtoTsinghuaUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementforthedegreeofMasterofScienceinBiomedicalEngineeringbyLiXinThesisSupervisor:ProfessorHuangGuoliangMay,2013关于学位论文使用授权的说明本人完全了解清华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：清华大学拥有在著作权法规定范围内学位论文的使用权，其中包括：（1）已获学位的研究生必须按学校规定提交学位论文，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生上交的学位论文；（2）为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所供校内师生阅读，或在校园网上供校内师生浏览部分内容。本人保证遵守上述规定。（保密的论文在解密后遵守此规定）作者签名：导师签名：日期：日期：摘要图4.13所示。荧光图上各点均可清晰分辨，个别点信号较弱，可能的原因是芯片制作过程中SU8硅片的损坏或是UNPs荧光材料填充不足。横纵线剖面统计曲线显示各峰均可分辨。实验证明，所搭建的UNPs荧光在体成像平台可对25μm样点尺寸微阵列芯片进行在体检测。统计图像信噪比(SignaltoNoiseRatio,SNR)，得到SNR=78(ImageJ1.42q)。高信噪比暗示系统可以分辨比50μm中心距靠得更近的样点。但是由于工艺的限制，用光刻法加工SU-8硅片的最小尺寸精度只能达到约25μm。改进REP的制造方法，如利用铬板模具，加工出更微小的微阵列芯片对系统分辨率进行评估，有望评估到更高的系统分辨率检测限。图STYLEREF1\s4.SEQ图\*ARABIC\s112小鼠全身在体成像(红圈内为芯片所在位置)。(a)白光图，(b)UNPs荧光图图STYLEREF1\s4.SEQ图\*ARABIC\s113UNPs芯片在体显微成像在体生物芯片的应用前景目前有文献报道，肿瘤的生长与发展不仅依赖肿瘤细胞的恶性潜能，而且还依赖于肿瘤细胞与其他种类细胞（如正常细胞、基质细胞、上皮细胞、免疫细胞和炎症细胞等）之间的多向互动作用。这些相互作用极有可能是肿瘤病变唯一特有的，即具有肿瘤特异性，且在随着时间和空间的变化而变化，同样具有特异性ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[\o"Celis,2004#400"77]。正常组织的癌变也会反应在细胞间质液的成分中，尤其是肿瘤细胞间质液(tumorinterstitialfluid,TIF)。因此，肿瘤细胞间质液成为挖掘肿瘤生物标记物的重要生物来源之一。有研究发现，肿瘤微环境中的可溶因子如细胞因子、生长因子等可促成肿瘤的发生与发展。同时，肿瘤细胞向细胞间质液分泌或流出的蛋白质也有可能成为肿瘤标记物ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[\o"Sun,2010#403"78]。除了肿瘤细胞间质液，对诸如血清、血浆、组织溶解液、尿液、乳液、泪液以及羊水等生物标记物源液进行分析，可以获得丰富的肿瘤生物标记物信息。这些肿瘤标记物对于临床中肿瘤的早期检测、治疗、疗效评估等具有非常广泛的使用价值。然而，肿瘤细胞会释放特异性物质干扰组织并引起局部反应，潜在的肿瘤标记物往往来源于局部病变组织，如固体瘤等。因此，肿瘤组织或者附近的肿瘤标记物含量更高，而其他源液如血浆、血清等，往往由于对标记物产生了稀释作用而使肿瘤标记物浓度大幅度降低，不利于对低丰度肿瘤标记物的检测ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wiig</Author><Year>2010</Year><RecNum>402</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[79]</style></DisplayText><record><rec-number>402</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="9aa2xs024pape3errz35w2de2vwxxv9v9vv0">402</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wiig,H.</author><author>Tenstad,O.</author><author>Iversen,P.O.</author><author>Kalluri,R.</author><author>Bjerkvig,R.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofBiomedicine,UniversityofBergen,Bergen,Norway.helge.wiig@biomed.uib.no.</auth-address><titles><title>Interstitialfluid:theoverlookedcomponentofthetumormicroenvironment?</title><secondary-title>FibrogenesisTissueRepair</secondary-title><alt-title>Fibrogenesis&tissuerepair</alt-title></titles><periodical><full-title>FibrogenesisTissueRepair</full-title><abbr-1>Fibrogenesis&tissuerepair</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>FibrogenesisTissueRepair</full-title><abbr-1>Fibrogenesis&tissuerepair</abbr-1></alt-periodical><pages>12</pages><volume>3</volume><dates><year>2010</year></dates><isbn>1755-1536(Electronic) 1755-1536(Linking)</isbn><accession-num>20653943</accession-num><urls><related-urls><url>/pubmed/20653943</url></related-urls></urls><custom2>2920231</custom2><electronic-resource-num>10.1186/1755-1536-3-12</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[\o"Wiig,2010#402"79]。2004年，Ceil等人通过蛋白质组学手段研究人乳腺癌细胞间质液中的蛋白质组成ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[\o"Celis,2004#400"77]。他们从上千种蛋白质中鉴定出267种与乳腺癌相关的蛋白质，为乳腺癌细胞间质液中肿瘤标记物的发现提供依据，在肿瘤细胞间质液研究领域做出了重要贡献。2010年，Sun等人研究了肝肿瘤细胞间质液中潜在的生物标记物ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[\o"Sun,2010#403"78]。他们通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS），对小鼠肝肿瘤细胞间质液进行提取分离，并利用线性离子阱质谱仪进行分析，鉴定出1450种从肿瘤细胞膜囊流出或是与细胞分解产物相关的蛋白质。并发现从肿瘤细胞间质液中的蛋白质可能会从肝组织释放到血浆中，成为病变来源，可以作为肝组织的血液生物标记物。包括上述文献在内的众多研究均表明，肿瘤细胞间质液可作为挖掘生物标记物的重要来源。随着生物医学领域研究的不断深入，在未来极可能需要对多个生物标记物进行并行检测，才能获得一种或者多种疾病的相关信息。在TIF生物标记物研究的基础之上，研究制备可以与生物标记物特异性结合的探针，并且点样在PDMS微阵列芯片上，并对UNPs进行功能化修饰，使其可与biomarker相结合。当疾病发生时，UNPs标记的biomarker会与包埋其中的芯片特异性探针相结合，通过一段时间的富集增强信号，再用本研究发展的高分辨率在体芯片检测方法对其进行在体实时观察，就可以实现在线监测疾病的发展变化。随着研究的不断深入，某些疾病的发生发展变化情况不一定通过一种biomarker得以反映，而是通过几种甚至几十种biomarker协同反映。利用在体微阵列芯片及其检测技术，借助其高通量，高灵敏度的优点，更有利于对多种biomarker的并行实时监测。本章小结本章首先对适用于在体成像的UNP芯片材料生物相容性进行了验证，以此为基础设计并制备了应用于在体成像的三种尺寸UNP微阵列芯片。其次，利用所搭建平台，实现了离体皮下芯片荧光成像；再次，研究了利用光透明试剂对活体小鼠皮肤进行透明处理的方法，进一步提高了皮下荧光检测的分辨率，实现了样点大小25μm，中心距50μm的UNP微阵列芯片的在体荧光成像检测。第5章痕量爆炸物的快速鉴定技术及应用研究痕量爆炸物的快速鉴定技术及应用研究研究背景在爆炸残留物测量领域，目前普遍使用的色谱、质谱等传统分析仪器，在现场实际应用中存在一定的局限性，如体积大、操作相对比较复杂、检测时间长、仪器比较昂贵，不适合大面积配备使用。在恐怖爆炸案现场，往往需要对成百上千的碎片土样进行检测鉴定，急需一种灵敏快速、操作简单、价格低廉的检测鉴定技术方法，可大面积配备使用，对海量爆炸物样品进行快速鉴定分析。光谱检测原理与存在问题紫外-可见-红外(ultraviolet-visible-infrared,UV-Vis-IR)光谱测量在爆炸物检测中的应用非常普遍。光谱检测技术依据朗伯-比尔定理，如下式(5-1)所示： (STYLEREF1\s5SEQ式\*ARABIC\s11)式中，A为吸光度，即溶液对光的吸收程度；I0为溶剂光谱；It为溶液光谱；b为液层厚度(光程长度)；c为溶液的摩尔浓度；ε为摩尔吸光系数。不同物质由于分子官能团不同，会使其吸收光谱峰存在差异。通过测量溶剂与溶液的光谱，算出吸收光谱，即可得到光谱峰的位置、大小与形状，进而对物质进行检测鉴定。传统UV-Vis-IR光谱测量方法在实际应用中存在如下局限性：一、鉴定特异性低。传统方法依靠吸收光谱峰的位置对物质进行识别，在物质的吸收光谱峰位相近（<5nm）时就难以识别。爆炸物如三硝基甲苯（TNT）、环四次甲基四硝胺（HMX）、三硝基苯甲硝胺（CE）等峰位相差不足3nm，利用峰位方法无法对其进行识别。二、样品耗量高传统方法用比色皿盛放样品进行测量，比色皿对样品量需求较大，一般在50μL至几毫升之间。无法满足样品量稀少情况下的检测。新的光谱鉴定方法与检测系统结构针对传统光谱鉴定技术存在的问题，我们提出了新的方法如下REF_Ref355180302\h图5.1所示。在鉴定识别之前先创建指纹库，对各种物质的标准液吸收光谱进行测量存入指纹库中；在鉴定识别中先对待测液的吸收光谱进行测量，再与指纹库中各标准指纹进行比对，用新开发的特征匹配算法（FeatureMatchingAlgorithm,FMA）进行分析鉴定。图STYLEREF1\s5.SEQ图\*ARABIC\s11新的光谱鉴定方法本方法可分为光谱检测与光谱识别两部分。光谱检测装置示意图如REF_Ref355181005\h图5.2所示。UV-Vis-IR光进入光纤传感探头经反射镜反射，往返两次透过被夹持的微纳升样品液滴，再经过6根输出光纤，进入光谱仪进行测量。夹持在反射镜与探头之间的液滴近似为圆柱体形，其半径与高分别在250m~1mm，0.1~0.5mm范围内，对应体积为20nL～2μL。单次测量的总时间约3秒。光谱识别算法示意图如下所示。首先将待测液的光谱与指纹库中各标准光谱进行组合。其次对标准光谱曲线与某一常量进行相乘加权，使其与待测液光谱曲线最大值相等。再利用式（5-2）求出平方逼近误差(SquareApproximationError)，对两条曲线的差异进行定量： (STYLEREF1\s5SEQ式\*ARABIC\s12)式中，、分别为待测液与标准液加权后的光谱向量。最后，将与指纹库中所有标准光谱组合比对识别计算得到的SAE值进行t-test比较，具有显著性差异的最小SAE对应的标准指纹即为未知待测液对应的爆炸物。图STYLEREF1\s5.SEQ图\*ARABIC\s12微纳体系光纤传感测量系统图STYLEREF1\s5.SEQ图\*ARABIC\s13FMA算法识别爆炸物吸收光谱光谱检测结果实验对七种爆炸物[季戊四醇四硝酸酯(PETN)，三硝基苯甲硝胺(CE)，三硝基甲苯(TNT)，二硝基甲苯(DNT)，苦味酸(PA)，环四次甲基四硝胺(HMX)，环三次甲基三硝铵(RDX)]的梯度浓度溶液光谱进行了检测，检测结果如下REF_Ref355183954\h图5.4所示。对光谱曲线进行分析，将各浓度梯度曲线进行线性拟合，用式(3-9)计算各爆炸物的浓度检测限，得到峰位、检测限、测量范围、线性度如下REF_Ref355185035\h表5.1所示。实验结果表明本光谱检测装置可实现低耗量、低检测限的光谱检测。图STYLEREF1\s5.SEQ图\*ARABIC\s14七种爆炸物溶液的吸收光谱表STYLEREF1\s5.SEQ表\*ARABIC\s11常见爆炸残留物鉴别峰位置与检出限爆炸物名称测量范围(mg/L)线性度（R2）峰位(nm)探测限(mg/L)PETN5-2500.9989198.32.1DNT1-2000.9993203.5/242.30.3RDX2.5-2500.9999206.31.0PA1-1000.9997229.7/335.20.5HMX2.5-2500.9998224.10.6CE1-1000.9999225.50.6TNT1-1000.9999223.70.5FMA爆炸物识别实验中用FMA算法对峰位非常接近的CE、HMX、TNT三种爆炸物进行识别。实验结果如下REF_Ref355186578\h图5.5所示。实验结果中，爆炸物待测液与其对应的标准指纹比对计算得到的SAE值最小，且与其他两种爆炸物标准指纹的SAE具有显著性差异。实验结果表明FMA算法可实现峰位非常接近(3nm)的爆炸物识别。图STYLEREF1\s5.SEQ图\*ARABIC\s15FMA爆炸物识别结果。***:P<0.001实验进一步对爆炸现场采集的土样(由中国公安部物证鉴定中心提供)进行爆炸物鉴定。实验分别对十组爆炸现场土样与爆炸现场附近空白土样的吸收光谱进行检测，对其取平均并相减，得到光谱曲线如下REF_Ref355187794\h图5.6（a）所示。相减后的光谱曲线其峰位在227nm处，与CE、HMX、TNT相近，因此将其与指纹库中CE、HMX、TNT的标准指纹进行FMA比对，得到结果如下REF_Ref355187794\h图5.6（b）所示。比对结果中，土样光谱与CE标准指纹相似度最高，表明土样中最有可能含有CE爆炸物。中国公安部物证鉴定中心用质谱/高效液相色谱方法对同一批土样进行检测，得到相同结果。实验证明本研究方法可实现实际爆炸现场土样的快速鉴定。(a)(b)图STYLEREF1\s5.SEQ图\*ARABIC\s16爆炸现场土样的鉴定。(a)土样吸收光谱曲线，(b)FMA识别结果；***:P<0.001本章小结本章研究了痕量爆炸物的快速鉴定技术及其应用。首先，利用微纳体系光谱检测装置，对七种爆炸物的吸收光谱进行了检测，理论上需要的样品最低耗量为20nL，检测限达到0.5mg/L，单次测量的时间约3秒。其次，提出了FMA爆炸物识别算法，实现了峰位相近(<3nm)的三种爆炸物识别。最后用提出的装置方法，对实际爆炸现场土样进行了鉴定，结果与质谱/高效液相色谱联用鉴定结果一致，证明了本方法可实现爆炸现场土样的低耗量快速识别与初步筛选。第6章总结与展望总结与展望本文工作总结本文工作主要包括三个方面：一、利用有限元方法成功对UNPs荧光在复杂形状生物组织中的传输特性进行理论仿真，对实际UNPs荧光材料的形貌、光谱、非线性特性进行了检测评估。二、成功搭建了UNPs荧光在体成像系统平台，通过制备组织仿体对系统平台各组成部分进行优化以及对系统性能进行评估，实现了高灵敏度，高分辨率的在体荧光检测。三、利用光透明技术，提出了一种UNPs微阵列芯片的在体检测方法，实现了25×25μm样点尺寸（中心距：50μm）微阵列芯片的高分辨率（50μm）、多通道并行在体检测。此外，本文还对痕量爆炸物的快速鉴定技术进行了研究，构建微纳样品光谱检测装置，提出FMA爆炸物识别算法，理论上需要的样品最低耗量为20nL，检测限达到0.5mg/L，实现了爆炸物现场土样的快速鉴定。以下分别对各部分工作进行总结。UNPs的特性研究一、利用耦合扩散方程组模型，通过有限元方法对上转换荧光在复杂形状生物组织中的传输进行仿真，发现上转换荧光在生物组织中对空间位置更敏感，将更有利于提高三维断层成像中荧光源的定位精度与空间分辨率。二、完成对实际UNPs荧光材料的形态、光谱、非线性特性的测量验证，结果表明所用UNPs具有较好的荧光光谱曲线，其强度与激发光功率之间具有二次方的关系，与文献报道一致，适合作为上转换荧光在体成像的标记材料。上转换荧光在体成像系统平台的构建一、搭建了上转换荧光在体成像系统平台，开发配套软件，对系统平台进行运动控制、图像采集与分析。二、研制了包埋UNPs的组织仿体，对系统平台进行了测试、优化。三、研制了一系列包埋不同浓度UNPs的组织仿体，对系统平台的灵敏度进行了评估；实验结果证明本系统平台的灵敏度为0.93×10-4wt%，相比报道文献提高3.8倍。四、利用微加工技术，研制了含微结构的空间分辨率评估仿体，对系统平台在浅层组织中的空间分辨率进行了评估；实验结果证明系统平台在0.5mm深处的空间分辨率极限约100μm。五、用搭建平台对包埋荧光的活体小鼠进行实验，验证了利用本平台进行上转换荧光在体成像的可行性。UNPs微阵列芯片的在体检测一、设计并制备了用于在体检测可行性验证的UNPs微阵列芯片(探针大小：25×25μm，50×50μm，100×100μm；中心距；50μm，100μm，200μm)。二、利用新鲜的小鼠离体皮肤覆盖芯片，通过搭建平台对皮下芯片进行检测，实验结果表明本平台的实际皮下检测分辨率达到100μm，可检测的最小芯片探针大小为50×50μm。三、研究了光透明剂对活体小鼠皮肤的处理方法，采用PEG400与噻酮混合液，实现了活体小鼠皮肤的透明化处理，离体皮肤实验证明在透明化试剂处理后，平台的皮下检测分辨率提高至50μm，可检测的芯片最小探针为25×25μm.四、将UNP微阵列芯片植入活体小鼠皮下，研究抑制小鼠呼吸运动的方法，并利用搭建的系统平台，实现了25×25μm大小探针的微阵列芯片在体成像。痕量爆炸物的快速鉴定技术研究及应用一、利用微纳样品光谱检测装置对七种爆炸物的吸收光谱进行了测量，实现了低耗量(20nL)，低检测限(0.5mg/L)的快速检测(3秒)。二、提出FMA光谱识别算法，实现了不同浓度下峰位相近(<3nm)的三种爆炸物(TNT、CE、HMX)识别。三、对实际爆炸现场土样进行了爆炸物鉴定，结果与质谱/高效液相色谱分析结果一致，证明了微纳样品光谱检测装置结合FMA光谱识别算法，可用于实际爆炸现场土样的快速识别筛选。对未来工作的展望本论文对散射介质中上转换荧光的传输进行了模拟仿真，结果证明与传统线性荧光材料相比，上转换荧光物质对其在散射介质中的位置敏感度更高。这一结论预示，用上转换荧光物质作为三维荧光断层成像的造影剂，将获得更高的成像分辨率和定位精度，这一设想已被最新的研究所证明ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Xu</Author><Year>2012</Year><RecNum>425</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[49]</style></DisplayText><record><rec-number>425</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="9aa2xs024pape3errz35w2de2vwxxv9v9vv0">425</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Xu,CanT.</author><author>Svenmarker,Pontus</author><author>Liu,Haichun</author><author>Wu,Xia</author><author>Messing,MariaE.</author><author>Wallenberg,L.Reine</author><author>Andersson-Engels,Stefan</author></authors></contributors><titles><title>High-ResolutionFluorescenceDiffuseOpticalTomographyDevelopedwithNonlinearUpconvertingNanoparticles</title><secondary-title>ACSNano</secondary-title></titles><periodical><full-title>AcsNano</full-title><abbr-1>AcsNano</abbr-1></periodical><pages>4788-4795</pages><volume>6</volume><number>6</number><dates><year>2012</year><pub-dates><date>2012/06/26</date></pub-dates></dates><publisher>AmericanChemicalSociety</publisher><isbn>1936-0851</isbn><urls><related-urls><url>/10.1021/nn3015807</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1021/nn3015807</electronic-resource-num><access-date>2013/04/08</access-date></record></Cite></EndNote>[\o"Xu,2012#425"49]。然而，最新报道中虽然采用了上转换荧光的性质实现了更高分辨率的三维成像，但所用的散射模型为长方体形状，所采用的检测方法为平面点扫描式，存在如下两个问题：一方面其模型外形与实际动物的复杂外形还有较大差距；另一方面平面点扫描方法所获得的光子空间采集率还较低。因此UNPs荧光断层成像的空间分辨率以及应用范围仍然有较大的提升空间。VasilisNtziachristos小组搭建的360°旋转扫描非接触式荧光分子断层成像系统ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Deliolanis</Author><Year>2007</Year><RecNum>153</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[21]</style></DisplayText><record><rec-number>153</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="9aa2xs024pape3errz35w2de2vwxxv9v9vv0">153</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Deliolanis,N.</author><author>Lasser,T.</author><author>Hyde,D.</author><author>Soubret,A.</author><author>Ripoll,J.</author><author>Ntziachristos,V.</author></authors></contributors><auth-address>Deliolanis,N MassachusettsGenHosp,LabBioopt&MolImaging,CtrMolImagingRes,Charlestown,MA02129USA MassachusettsGenHosp,LabBioopt&MolImaging,CtrMolImagingRes,Charlestown,MA02129USA HarvardUniv,SchMed,Charlestown,MA02129USA</auth-address><titles><title>Free-spacefluorescencemoleculartomographyutilizing360degreesgeometryprojections</title><secondary-title>OpticsLetters</secondary-title><alt-title>OptLett</alt-title></titles><periodical><full-title>OpticsLetters</full-title><abbr-1>OptLett</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>OpticsLetters</full-title><abbr-1>OptLett</abbr-1></alt-periodical><pages>382-384</pages><volume>32</volume><number>4</number><dates><year>2007</year><pub-dates><date>Feb15</date></pub-dates></dates><isbn>0146-9592</isbn><accession-num>ISI:000244083700020</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://000244083700020</url></related-urls></urls><language>English</language></record></Cite></EndNote>[\o"Deliolanis,2007#153"21]，可以应用于实际动物的荧光断层成像，并且可有效提高光子空间采集率，从而提高空间分辨率。因此，在未来工作中，搭建360°旋转扫描断层成像系统，结合UNPs作为造影剂，有望突破荧光断层成像技术的分辨率极限并应用于实际小动物在体成像中。本论文只是对UNPs微阵列芯片在体荧光检测进行了可行性验证，还没有实现高通量的生物标记物在体检测。目前已有多篇文献报道了对组织间质液中生物标记物筛选的成果ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[\o"Celis,2004#400"77,\o"Sun,2010#403"78]。在此基础上，要利用UNPs微阵列芯片实现对多种生物标记物在体高通量的检测，后续还需要进行两方面的研究探索。一方面，需发展有效的UNPs功能化修饰方法，使其能与TIF中疾病相关的生物标记物特异性的结合；另一方面，需研究能与生物标记物特异性结合的芯片探针，并将其点样固定在芯片上。当疾病出现时，UNPs标记的biomarker会与插入其中的芯片特异性探针相结合，再用本研究发展的高分辨率、高灵敏度在体成像检测方法对其进行在体实时观察，即有望得到疾病发展变化的原位在线的高通量检测结果。实验证明了所构建系统平台的皮下检测灵敏度可达到0.93×10-4wt%，与文献报道的单细胞在体荧光检测系统对比，检测灵敏度提高了3.8倍ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wang</Author><Year>2012</Year><RecNum>311</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[80]</style></DisplayText><record><rec-number>311</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="9aa2xs024pape3errz35w2de2vwxxv9v9vv0">311</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wang,Chao</author><author>Cheng,Liang</author><author>Xu,Huan</author><author>Liu,Zhuang</author></authors></contributors><titles><title>Towardswhole-bodyimagingatthesinglecelllevelusingultra-sensitivestemcelllabelingwitholigo-argininemodifiedupconversionnanoparticles</title><secondary-title>Biomaterials</secondary-title></titles><periodical><full-title>Biomaterials</full-title><abbr-1>Biomaterials</abbr-1></periodical><pages>4872-4881</pages><volume>33</volume><number>19</number><keywords><keyword>Upconversionnanoparticles</keyword><keyword>Oligo-arginine</keyword><keyword>Mesenchymalstemcells</keyword><keyword>In聽vivoimaging</keyword><keyword>Single-cellleveltracking</keyword></keywords><dates><year>2012</year></dates><isbn>0142-9612</isbn><urls><related-urls><url>/science/article/pii/S0142961212003341</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>[\o"Wang,2012#311"80]。另外，所构建的系统平台的空间分辨率经证明可达到50μm，假设细胞直径为20μm且紧密相连，细胞间隙忽略不计，理论计算本系统可分辨约6个细胞，接近单细胞水平。系统对25×25μm芯片进行在体成像检测，获得的高信噪比图像暗示系统可以分辨比50μm中心距的更靠近的样点。由于工艺的限制，目前用光刻法加工SU-8硅片的最小尺寸精度只能达到25μm。改进或是改变REP的制造方法，如利用铬板模具，加工出更微小的微阵列芯片来对系统分辨率进行评估，可以提高系统分辨率极限。此外，现有的光透明技术方法仍有改善的空间。通过改进现有光透明技术方法可进一步降低皮肤的散射系数，从而提高皮下荧光检测的分辨率。因此，未来工作在系统上通过以上几方面的改进，将有望实现单细胞的在体成像检测。参考文献参考文献ADDINEN.REFLIST[1] 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