细胞工程第7章 干细胞

第7章

干细胞

(StemCell)什么是干细胞(stemcells)干细胞是具有自我更新(Self-renewal)和分化潜能(Potency)的细胞。Mouseembryonicstemcellswithfluorescentmarker.HumanEmbryonicStemcellcolonyonmouseembryonicfibroblastfeederlayer.2干细胞的分类按来源分类胚胎干细胞成体干细胞按分化潜能分类

多能干细胞

全能干细胞

专能干细胞

3胚胎干细胞和成体干细胞的比较定义:是从早期胚胎内细胞团(或生殖脊)分离，并经体外抑制分化培养所获得的干细胞。特点：具有很强的分化能力，可以无限增加，并且可以分化成全身２００多种细胞类型。总结：它能长成动物的任何组织和器官成体干细胞位于成体的组织和器官特点：在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序进行分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。

4美国威斯康辛大学（UniversityofWisconsin）科学家汤姆森（JamesA.Thomson）带领研究团队首次从人类胚胎组织中提取培养出胚胎干细胞（EmbryonicStemCell，ESCell）株，并且证实此株细胞具有全能干细胞特征，此项研究论文发表在1998年11月6日出版的顶级学术期刊Science上.这篇论文标着着一个时代的到来，而汤姆森也被人称作"干细胞研究之父"。JamesA.Thomsonthomson@5

1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。

67.1胚胎干细胞

（embryonicstemcells,ES细胞）

四个基本问题:什么是ES细胞？（定义）如何分离培养ES细胞（建系）如何鉴定ES细胞？ES细胞有何应用价值？7

受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子

合子卵裂球桑椹胚囊胚滋养层胎盘及胎儿附属结构囊胚内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。内细胞团中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统外胚层体表结构；神经系统人早期胚胎发育8胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞）胚胎生殖细胞（embryonicgermcells,EG细胞）97.1.1胚胎干细胞的生物学特性参见7.1.3ES细胞的鉴定10获取早期发育胚胎分离囊胚的内细胞群ES细胞体外培养，细胞非分化增殖ES细胞的鉴定ES的传代和冻存7.1.2胚胎干细胞的建系建系步骤：11（1）细胞形态特征、取材部位（2）细胞表面的特殊标志（3）细胞内干细胞标志基因的表达（4）端粒酶（5）核型分析体内分化（6）分化潜能

体外分化嵌合体:利用ES细胞可以获得具有来自两个或多个合子体细胞的个体，又叫镶嵌体7.1.3

胚胎干细胞的鉴定12形态学鉴定：典型的ES细胞体积较小，有一个大核，核内有一个或多个明显的核仁，胞质较少。细胞之间界限不清晰，紧密聚集呈鸟巢状克隆。

13胚胎干细胞的特性14分化能力检测ES细胞具有发育全能性，这是其区别于其它细胞的显著特点。ES细胞一旦脱离饲养层或除去分化抑制物后进行培养，会自发分化为多种细胞。在某些物质的诱导下，一些特定基因的表达变化，从而使ES细胞发生定向分化。15分化能力检测①体外分化试验：将所培养的细胞制成悬液在铺有明胶的培养皿中培养，则贴壁生长的ES细胞会自发地分化为各种细胞，而悬浮生长的ES细胞会形成简单类胚体，然后进一步形成囊状胚体。②体内分化试验：将一定量培养的ES细胞注入同源动物的皮下，过一段时间后会形成组织瘤，且组织瘤内有三个胚层的细胞存在。③核移植检测：将培养的细胞作为核供体注入去核卵母细胞中，观察重构胚是否正常发育。④嵌合体形成检测：将培养的细胞与受体胚胎结合并移植入同期假孕受体，ES细胞可参与受体胚胎的发育从而得到嵌合体动物，然后通过毛色判断，或同工酶检测。16（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等（2）将ES细胞与特定的细胞共培养（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内干细胞诱导分化的常用方法17胚胎干细胞的体外定向诱导分化：

胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－造血细胞

RA胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－神经细胞

DMSO胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－肌肉细胞

TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－血管和内皮细胞

RA+胰岛素+T3胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－脂肪细胞

BMP-2,BMP-4胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－软骨细胞

地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－骨细胞

基因转染胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－胰岛素分泌细胞187.1.4ES细胞的应用前景

及面临的难题胚胎干细胞研究是把双刃剑19胚胎干细胞研究的意义（应用前景）研究哺乳动物个体发生发育规律研究细胞分化研究基因功能生产转基因动物治疗性克隆研究细胞癌变机理及新药物的筛选20胚胎干细胞+

体细胞克隆=治疗性克隆(therapeuticcloning)21美科学家使小鼠胚胎干细胞发育成为成熟精子

22胚胎干细胞研究面临的难题增殖与分化的矛盾潜在致癌机制器官形成困难重重伦理冲突23伦理冲突ES研究也引发了当前最为激烈而敏感的伦理之争。主要围绕两个问题而展开：一是如何看待胚胎。ES主要有三个来:

（1）（自然和人工）流产的胚胎；（2）辅助生殖剩余的胚胎；（3）通过体细胞核转移术得到的胚胎。不管哪一个来源，提取ES必定会损毁胚胎。于是，胚胎是不是生命，是不是人，研究ES是不是“毁灭生命”、“杀人”，很自然地成为争论的焦点。24如何解决伦理矛盾不破坏胚胎的情况下获取胚胎干细胞成体干细胞横向分化睾丸细胞：胚胎干细胞的新来源iPS252006年8月24日，美国学者兰萨领导的研究小组在《自然》杂志发表文章，宣称已实现在不破坏胚胎的情况下获取胚胎干细胞。这一成果如果得到学界承认，将是这一研究领域的一大进步。不再“杀鸡取卵”的胚胎干细胞研究将赢得充分的发展空间。26成体干细胞横向分化已经由多项研究证明，之前被认为发展很有限的特定组织中的成体干细胞在一定的条件下还能够形成其他组织的细胞类型，这些发现为干细胞新资源的探索和更广泛应用奠定了基础。

271自我更新的机理，定向分化的机理2胚胎干细胞建系（尤为人胚胎干细胞）3治疗性克隆4胚胎干细胞定向发育成三维器官5胚胎干细胞移植的安全性问题胚胎干细胞的重点研究方向28不同国家、地区的人胚胎干细胞研究政策允许或制定灵活的ES研究政策：允许或采取灵活的ES研究政策：澳大利亚，比利时，巴西，加拿大，中国，捷克斯洛伐克，丹麦，爱沙尼亚，芬兰，法国，希腊，匈牙利，冰岛，印度，以色利，日本，拉脱维亚，荷兰，新西兰，俄国，新加坡，斯洛文尼亚，南非，韩国，西班牙，瑞典，瑞士，中国台湾，泰国，英国。严格限制：德国，意大利，香港。完全禁止：奥地利，爱尔兰，立陶宛，挪威，波兰。29

7.2成体干细胞

（Adultstemcell）概念：

成体干细胞是在成体组织内具有自我更新能力并能分化产生一种或一种以上子代组织细胞的未成熟细胞。成体干细胞的特点数量少，难以识别、分离纯化体外培养时不能长时间增殖具有可塑性※（神经干细胞—造血干细胞）在完全分化前经历一个中间类型即祖细胞阶段※可塑性（plasticity）造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞等成体干细胞具有一定跨系、甚至跨胚层分化的特性，称其为干细胞的“可塑性”。31成体干细胞种类造血干细胞间充质干细胞精原干细胞神经干细胞表皮干细胞肠干细胞肝干细胞32造血干细胞

(hematopoieticstemcells，HSCs)

造血干细胞是从血液、骨髓、脐带血来源的一群原始造血细胞，其能自我更新、分化成一些具有组织特化的细胞，能从骨髓中游离出来进入血液循环、能发生程序性死亡的细胞。造血干细胞是最早发现，研究最多和最先用于治疗疾病的成体干细胞。造血干细胞移植是从60年代逐渐发展起来的一种医疗技术，由于最初是通过抽取供体骨髓而获得造血干细胞,所以又称为骨髓移植。近10年来，由于科学的进步，人们已可通过一些药物将骨髓中的造血干细胞动员到外周血中，通过血细胞分离机分取造血干细胞，称为外周血干细胞移植。造血干细胞34三个部位生产/存储造血干细胞大部分在骨髓里，即骨髓造血干细胞。在外周血液中，也就是在血管里面有少量的造血干细胞。在脐带里有丰富的造血干细胞。

骨髓；1/400

外周血；1/100000

脐带血；1/10000

造血干细胞的来源35

造血干细胞的分离和鉴定免疫吸附法（抗原和抗体特异性结合）磁性标记CD34单克隆抗体加入供体外周血抗原和抗体特异性结合通过分选系统造血干细胞吸附到柱子上其他细胞留在血液中造血干细胞的应用造血干细胞移植可以治疗多种血液病、实体瘤、免疫缺陷病和重度急性放射病，这已被很多人所熟悉。基因治疗:造血干细胞以其自我复制和分化潜能的特点,成为基因治疗最理想的靶细胞之一。科学家们在对造血干细胞的研究中还取得了许多新进展并发现许多新功能，研究结果表明造血干细胞具有可塑性，可以转变为血管、肝脏、脂肪、神经、肌肉等组织细胞，并深入探讨了造血干细胞治疗冠心病、神经损伤、血管闭塞性疾病等方面的新应用。

37骨髓移植技术使众多白细胞患者得到救治，使急性白血病患者的长期生存率提高到50%-70%。为发展此项技术做出了重要贡献的美国医学家托马斯因而获得了1990年度的诺贝尔医学奖。1976年托马斯报道100例晚期白血病病人经HLA相合同胞的骨髓移植后，13例奇迹般长期生存。从此全世界应用骨髓移植治疗白血病，再生障碍性贫血及其他严重血液病，严重血液功能缺陷病，急性放射病，部分恶性肿瘤等方面取得巨大成功，开创临床治疗白血病及恶性肿瘤的新纪元。骨髓移植中国骨髓移植奠基人陆道培教授于1964年在亚洲首先成功开展了异体(同基因)骨髓移植38众多实验表明，人脐带血中含有大量早期造血干细胞。体外培养中，其增殖能力及生存时间均优于骨髓造血细胞，脐血中淋巴细胞亦有与成人外周血不同的生物学特征，主要表现为发育上更原始，抗原表达及增殖性应签反应较弱迄今，均脐血干细胞移植已广泛应用于多种恶性和非恶性疾病的治疗，结果令人鼓舞。目前，许多国家都在积极着手建立脐血库。脐血