长期毒性作用及其试验方法

第十五章长期毒性作用及其试验方法

long-termtoxicityimpact

andtestmethod

2023/6/271长期毒性作用及其试验方法

第一节基本概念和目的第二节试验设计原则及方法2023/6/272长期毒性作用及其试验方法

第一节基本概

念

和

目的2023/6/273长期毒性作用及其试验方法

长期毒性试验是指试验动物连续多日接触较大剂量的药物所引起的中毒效应，为观察这种中毒效应而设计的毒理学试验称之为长期(慢性)毒性试验。一、定义

急性毒性试验是为观察和评价急性毒性的有害作用或中毒反应而设计的一种毒理学试验。研究药物一次或24小时内多次给予受试药物后，一定时间内所产生的毒性反应。2023/6/274长期毒性作用及其试验方法5/20123给

药

的

期

限

不

同长期毒性试验与急性毒性试验的根本差别2023/6/275长期毒性作用及其试验方法6/20123给

药

的

期

限

不

同给

药

的

剂

量

范

围

不

同长期毒性试验与急性毒性试验的根本差别2023/6/276长期毒性作用及其试验方法

蓄积作用(accumulationaction)

当较长时间连续、反复给药时，如果给药的时间间隔和剂量超过机体消除药物的能力，就会出现药物进入机体的速度

(或总量)

超过排除的速度(或总量)

的现象，此时药物就有可能在体内逐渐增加并贮存起来，即蓄积作用。

2023/6/277长期毒性作用及其试验方法

蓄积作用的表现形式作用量积蓄功能性蓄积2023/6/278长期毒性作用及其试验方法9/20123给

药

的

期

限

不

同给

药

的

剂

量

范

围

不

同观

察

的

毒

效

应

不

同长期毒性试验与急性毒性试验的根本差别2023/6/279长期毒性作用及其试验方法二、目的与意义2023/6/2710长期毒性作用及其试验方法1预测受试物可能引起的临床不良反应2判断受试物反复给药的毒性靶器官或组织提示临床试验中需重点监测的指标43推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围为临床试验中的解毒或解救措施提供参考5长期毒性试验的目的2023/6/2711长期毒性作用及其试验方法

了解实验动物能耐受的最大剂量，找出完全无毒的安全界量，这个界量是判断一个待选新药是否有进一步开发研究的价值以及能否过渡到临床试用的重要依据，同时，也可为其它毒性实验和临床初始剂量的选择提供依据。因此长期毒性试验是临床前安全性评价的主要内容，它与急性毒性试验、生殖毒性以及致癌性等毒理学研究有着密切的联系，是新药报批临床时重点审评项目之一，是药物从药学研究进入临床试验的重要环节。长期毒性试验的意义2023/6/2712长期毒性作用及其试验方法第二节试验

设

计

原

则

及

方

法2023/6/2713长期毒性作用及其试验方法一、一般原则和要求基本原则全面、严谨、合理整体性随机、对照、重复2023/6/2714长期毒性作用及其试验方法一、一般原则和要求基本原则整体性长期毒性试验不能与药效学、药代动力性和其他毒理学研究割裂，试验设计应充分考虑其他药理毒理研究的试验设计和研究结果。长期毒性试验的结果应该力求与其他药理毒理试验结果互为印证、说明和补充。2023/6/2715长期毒性作用及其试验方法一、一般原则和要求总体原则选用两种实验动物三个剂量给药途径应与临床拟用途径相同2023/6/2716长期毒性作用及其试验方法一、一般原则和要求总体原则

至少在两种动物体上进行，兼顾雌雄性别。选用两种实验动物2023/6/2717长期毒性作用及其试验方法一、一般原则和要求总体原则三个剂量剂量至少分为高、中、低三个档次。高剂量组应能充分反映药物的毒性，低剂量组不出现毒性反应。同时设一溶剂(或赋形剂)对照组或已知药物毒性对照组。2023/6/2718长期毒性作用及其试验方法一、一般原则和要求总体原则给药途径应与临床拟用途径相同

口服给药大鼠一般常用灌胃，灌胃的容量为每天1~2ml/100g，也可将受试药物混在饲料或水中给予，但要保证每只动物按规定剂量在一定时间内服入，静脉注射大鼠时可采用腹腔代替，各剂量组采用等容量不等浓度给药。特殊情况另作说明。2023/6/2719长期毒性作用及其试验方法理想动物的标准：对受试物的生物转化与人体相近；对受试物敏感；已有大量历史对照数据。二、实验动物

2023/6/2720长期毒性作用及其试验方法☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。1.种类及品系二、实验动物

2023/6/2721长期毒性作用及其试验方法☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。1.种类及品系二、实验动物

Wistar大鼠SD大鼠

近亲繁殖鼠？杂交鼠？2023/6/2722长期毒性作用及其试验方法☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。1.种类及品系二、实验动物

一类新药：Beagle犬二类新药：杂种狗

2023/6/2723长期毒性作用及其试验方法☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。1.种类及品系二、实验动物

☆在吸入给药时，猴是首先推荐的动物，因为它在呼吸系统的解剖学和生理学方面比其它动物更接近人类。☆如研究计划生育用药，应选择猴或其他大动物。2023/6/2724长期毒性作用及其试验方法长期毒性作用及其试验方法长期毒性作用及其试验方法

Beagle犬：原产英国，纯种小猎兔犬

Beagle犬的特点：体型小,毛短,性情温和,亲人,抗病力强

缺点：价格昂贵2023/6/2727长期毒性作用及其试验方法2.起始月(周)龄一般选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物。二、实验动物

2023/6/2728长期毒性作用及其试验方法2.起始月(周)龄一般选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物。二、实验动物

长期毒性试验的给药期限较长；13原因：年龄较大的动物反应性降低,存在许多发性疾病干扰试验结果。处于生长发育阶段的动物对药物的毒性反应较敏感；232023/6/2729长期毒性作用及其试验方法啮齿类动物最好在断奶后不久即开始给药

大鼠起始周龄要求在

6~8周龄；

如果试验周期超过3个月以上，则将起始周龄降至

5~6周龄。狗的起始月龄为6月龄，一般不超过12月龄；如选用杂种狗，起始年龄可稍大些，但也不能超过5年。二、实验动物

2.起始月(周)龄2023/6/2730长期毒性作用及其试验方法起始体重应在体重均值±

20%的范围内。二、实验动物

2.起始月(周)龄2023/6/2731长期毒性作用及其试验方法3.性别及数量

（1）性别二、实验动物

☆一般来讲是兼用两种性别的动物，每个剂量组中雌雄性别的动物数必须一致。2023/6/2732长期毒性作用及其试验方法

在特殊情况下如药物对雄性（或雌性）生殖细胞的毒效应已确知，或者急性试验已证明药物对雌雄两性动物的毒性有明显差别时，就应主要选用敏感性别的动物进行试验。二、实验动物

3.性别及数量

（1）性别2023/6/2733长期毒性作用及其试验方法超过90天的试验啮齿类动物每组至少40只（雌雄各20只）；非啮齿类每组8~10只（雌雄各4~5只）。90天以内的试验啮齿类动物每组至少20只（雌雄各10只）；非啮齿类每组4~6只（雌雄各2~3只）；二、实验动物

3.性别及数量

（2）数量2023/6/2734长期毒性作用及其试验方法超过90天的试验啮齿类动物每组至少40只（雌雄各20只）；非啮齿类每组8-10只（雌雄各4~5只）。90天以内的试验啮齿类动物每组至少20只（雌雄各10只）；非啮齿类每组4~6只（雌雄各2~3只）；二、实验动物

3.性别及数量

（2）数量《指导原则》：一般大鼠为雌、雄各30只，

Beagle犬或猴各3~6只。2023/6/2735长期毒性作用及其试验方法4.饲养管理

严格控制环境条件，避免不必要的干扰因素是非常重要的。二、实验动物

2023/6/2736长期毒性作用及其试验方法酮症酸中毒室内温度饲料或饲料配方湿度光照通风条件饮水质量环境因素4.饲养管理二、实验动物

2023/6/2737长期毒性作用及其试验方法酮症酸中毒室内温度饲料或饲料配方湿度光照通风条件饮水质量环境因素4.饲养管理二、实验动物

啮齿类动物适宜温度为18~27℃。相对湿度为40%~70%。光照宜持续12小时明亮，12小时黑暗。通风条件良好。所用饲料应符合动物的营养标准。雌雄动物应分开饲养，每笼不宜超过5只2023/6/2738长期毒性作用及其试验方法酮症酸中毒室内温度饲料或饲料配方湿度光照通风条件饮水质量环境因素4.饲养管理二、实验动物

犬单笼饲养，定量喂食。

Beagle狗实验前至少驯养1~2周;

杂种狗应先检疫，驱虫。2023/6/2739长期毒性作用及其试验方法三、给药期限

按我国药政管理部门的要求，长期毒性试验的给药期限一般为临床疗程的3~4倍时间。创新药品试验周期应不少于90天，超过180天的新药可以在试验开始90天后，同时进行I期临床试验。2023/6/2740长期毒性作用及其试验方法我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定

临床拟用毒性试验期限给药时间啮齿类动物非啮齿类动物﹤5天

2周

2周﹤2周

1月

1月

2-4周

3月

3月

1-3月

6月

6月

﹥3月

6月

9月

每天给药最好固定时间。2023/6/2741长期毒性作用及其试验方法四、剂量水平的选择

三个剂量组是必不可少的：一个是足以引起明显的毒性反应的高剂量，但死亡率应控制在20%以内；第二个是不引起毒性作用的低剂量(一般为动物有效剂量或临床治疗量的2~3倍)；为表明毒性作用的量—效关系，在上述两个剂量之间插入一个(或多个)中间剂量。中剂量按计算

2023/6/2742长期毒性作用及其试验方法

在选择合适的剂量时还应考虑到：

①药物在体内的生物蓄积作用。对于高蓄积性药物应适当减少其剂量，否则在长期毒性试验结束时各剂量均有可能出现毒性作用；②药物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或“活化增毒”，而这些酶又是否易被药物本身所诱导或抑制。③药物在消化道中的稳定性。与胃肠道内容物有亲和性的药物，则应酌情增加剂量。

2023/6/2743长期毒性作用及其试验方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（LD50法）

根据急性毒性的LD50值决定三个剂量。一般在大鼠3个月长期毒性试验中，高、中、低三个剂量可分别采用约LD50的1/10、1/50和1/100剂量，狗各剂量组可采用大鼠相应各组的一半剂量。长期毒性作用及其试验方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（LD50法）（2）短期蓄积试验过渡法

根据急性毒性试验所提供的相关信息，如毒性的量—效关系，毒性出现的剂量范围及敏感动物等，先过渡到7天至21天的短期蓄积性试验，再将获得的参数外推于长期毒性试验。长期毒性作用及其试验方法急性毒性试验蓄积毒性试验和/或7天短期重复给药试验90天重复给药试验180天或更长期重复给药试验长期毒性作用及其试验方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（LD50法）（2）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学法

根据药代动力学最大有效安全浓度（MCD）大鼠3个月长期毒性试验时，低、中、高三个剂量可分别采用大鼠的1.0、3.3~6.6和10~20MCD;狗一般可采用大鼠一半左右的剂量。长期毒性作用及其试验方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（LD50法）（2）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学法（MBS法）根据大鼠急性毒性试验的最大耐受量(MTD)大鼠长期毒性试验的三个剂量分别为1、1/3及1/10MTD；狗和猴可采用大鼠一半左右的剂量。（4）最大耐受量法（MTD法）长期毒性作用及其试验方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（LD50法）（2）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学法（MBS法）

根据临床拟用剂量（3个月长期毒性试验）大鼠低、中、高三个剂量可分别采用50~100倍、25~50倍和

10~20倍临床剂量狗可分别采用30~50倍、15~25倍和5~10倍临床剂量猴可采用与狗相近的剂量或略低于狗的剂量进行试验（4）最大耐受量法（MTD法）（5）临床拟用剂量法（ACD法）长期毒性作用及其试验方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（LD50法）（2）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学法（MBS法）

根据人和动物的等效剂量比值，再按一定倍数扩大。（4）最大耐受量法（MTD法）（5）临床拟用剂量法（ACD法）（6）等效剂量法长期毒性作用及其试验方法不同动物的剂量折算系数

动物种属小鼠大鼠豚鼠兔猫猴狗人标准K(剂量折算系数)

1

7

12.3

27.5

29.7

64

124

388体重K(kg体重剂量折算系数)

1

0.71

0.62

0.37

0.30

0.32

0.21

0.11任何R(动物体型系数)

0.059

0.09

0.099

0.093

0.082

0.111

0.104

0.1体重W(标准体重kg)

0.02

0.2

0.4

1.5

2

4

12

70注：有些资料记载的动物体型系数（R）为此表中R值的1000倍，如小鼠R为59，大鼠R为90，这不影响药物剂量的折算。2023/6/2751长期毒性作用及其试验方法对于标准体重的动物：

每只用量（mg/只）DB＝DA·KBKA千克体重剂量（mg/kg）dB＝dB·KBKAKA，KB，RA，RB

值由上表查找2023/6/2752长期毒性作用及其试验方法对于任何体重的动物：

每只用量（mg/只）DB＝DA·RB·(WB)2/3RAWA千克体重剂量（mg/kg）dB＝dA·RB·(WB)2/3RAWA式中DB、dB

分别是欲计算的B种动物的每只剂量及公斤体重剂量，DA、dA

分别是已知A种动物的每只剂量及公斤体重剂量，WA、WB

是已知动物体重，RA、RB

是体型系数，可由上表查得。2023/6/2753长期毒性作用及其试验方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（LD50法）（2）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学法（MBS法）（4）最大耐受量法（MTD法）（5）临床拟用剂量法（ACD法）（6）等效剂量法长期毒性作用及其试验方法五、限度试验

我国药政部门规定，如小鼠急性毒性的口服给药剂量大于5g/kg，注射给药剂量大于2g/kg仍未产生毒性反应和死亡，或仅个别动物有毒性反应时，可考虑只做一个高于临床拟用剂量50倍(狗用30倍)的剂量组。2023/6/2755长期毒性作用及其试验方法

经济合作与开发组织(OECD)提出如果一种化合物以1000mg/kg的剂量，按规定期限连续给药，不产生任何可观察到的毒性反应，而且根据结构相关药物的已有资料，估计不会产生毒性的话，就不需要再用三个剂量来进行试验，除非预期临床需要更高的剂量。

五、限度试验2023/6/2756长期毒性作用及其试验方法六、给药方法长期毒性试验的给药途径一般应尽量与预期临床使用的途径相一致。临床用药途径为静脉或肌注时，3个月及以上的试验，由于试验周期长大鼠给药有困难，可用腹腔或皮下注射代替。如采用灌胃给药的方式可将供试药物制成一种溶液或混悬液，但必须注意给药容量不应超过1~2ml/100g体重/天。2023/6/2757长期毒性作用及其试验方法六、给药方法长期毒性试验一般均强调每天给药，每周必须给药7天。给药期限长（3个月或以上）的药物每周至少应给药6天。2023/6/2758长期毒性作用及其试验方法七、观察及测定指标

试验前，啮齿类动物至少应进行5天的适应性观察，非啮齿类动物至少应驯养观察1~2周，应对动物进行一般观察及血液生化学指标的检测。

试验期间，至少应每天或每两天作一次详细的观察。

试验结束时，必须留1/3的动物做恢复期的观察试验，其观察期时间一般不超过28天。2023/6/2759长期毒性作用及其试验方法（一）日常观察

1.一般观察内容

包括对实验动物被毛、皮肤、眼睛、粘膜、孔道(及其分泌物)、呼吸、循环、自主神经系统、躯体和肢体活动情况以及精神行为进行仔细地观察；对动物粪便的量、色泽和内含物，散失的食物，饮水瓶中残余的水以及一切可以反映动物生活情况变化的各种迹象，都必须加以注意。所有出现的症状都必须记录在案。2023/6/2760长期毒性作用及其试验方法1.一般观察内容

如果发现动物死亡，必须尽可能快地进行尸体剖检，以减少组织自溶。将组织置于10%的中性福尔马林或其它适宜的固定液中。如果尸体剖检不能立即进行，则必须将动物冷藏起来以延缓组织自溶。（一）日常观察

2023/6/2761长期毒性作用及其试验方法1.一般观察内容

对濒死的动物也应立即处死作尸体剖检。（一）日常观察

尸体剖检后行组织病理学检查、评价。2023/6/2762长期毒性作用及其试验方法2.生长率

（一）日常观察

2023/6/2763长期毒性作用及其试验方法3.食耗食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗的计算将加入供食器具中饲料的重量减去剩余的饲料重量再除以给食天数

（一）日常观察

2023/6/2764长期毒性作用及其试验方法3.食耗食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗的计算将给药组和对照组的食耗加以比较，有助于说明药物是否影响实验动物的食欲。

（一）日常观察

2023/6/2765长期毒性作用及其试验方法3.食耗食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗的计算将给药组和对照组的食耗加以比较，有助于说明药物是否影响实验动物的食欲。

（一）日常观察

如对食欲有影响，则每日进食量必然减少,体重增长亦受影响,但此时食物利用率并不一定降低

如果不影响食欲,而体重增长却下降,表明药物有可能影响食物的吸收或合成代谢,此时食物利用率就必然会有变化2023/6/2766长期毒性作用及其试验方法（二）测定指标

1.器官重量

涉及的主要器官有：

心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺、脑、

肾上腺、甲状腺、睾丸、前列腺、子宫等。

目的：确定靶器官2023/6/2767长期毒性作用及其试验方法２００５年ＳＦＤＡ组织编写

《药物研究技术指导原则》规定长期毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官：脑肝脏肾上腺脾脏附睾子宫心脏肾脏胸腺睾丸卵巢肺脏2023/6/2768长期毒性作用及其试验方法２００５年ＳＦＤＡ组织编写

《药物研究技术指导原则》规定长期毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官：脑肝脏肾上腺脾脏附睾子宫心脏肾脏胸腺睾丸卵巢肺脏甲状腺、前列腺2023/6/2769长期毒性作用及其试验方法长期毒性试验中进行病理组织学检查的组织或器官：脑（大脑、小脑、脑干）垂体甲状腺食管胃肝脏肾脏脾脏气管主动脉附睾卵巢前列腺坐骨神经眼（眼科检查发现异常时）＊给药局部淋巴结脊髓胸腺甲状旁腺唾液腺小肠和大肠胆囊＊肾上腺胰腺肺心脏睾丸子宫乳腺膀胱视神经＊骨髓注：＊为啮齿类动物可不进行组织病理学检查的组织或器官长期毒性作用及其试验方法1.器官重量

器官重量降低，表示该器官萎缩或发育不良；

器官重量增加提示可能有充血、水肿、增生、肥大、酶诱导变化或新生物等。

将动物处死后取出上述器官，除去附着的组织、除尽余血后立即称重（注意勿使组织干燥）。（二）测定指标

2023/6/2771长期毒性作用及其试验方法2.血液学（二）测定指标

常规的血液学参数骨髓涂片1.器官重量

2023/6/2772长期毒性作用及其试验方法２００５年ＳＦＤＡ组织编写

《药物研究技术指导原则》规定血液学指标红细胞计数红细胞容积平均红细胞血红蛋白网织红细胞计数血小板计数血红蛋白平均红细胞容积平均红细胞血红蛋白浓度白细胞计数及分类凝血酶原时间红细胞压积2023/6/2773长期毒性作用及其试验方法

血液学指标观察时间非啮齿类动物一般于整个试验周期中每隔1.5~

2个月采血测定一次各项指标。啮齿类动物

试验周期为6个月时，可于试验中期、试验末

期以及恢复期分别剖杀部分动物(约1/4、

2/4、1/4)，进行各项检查；

试验周期为3个月时，可于试验未期以及恢复

期分别剖杀部分动物(约2/3、1/3)，取血检查。（二）测定指标

2023/6/2774长期毒性作用及其试验方法3.血液生化学