显微注射针的制作

[注射针的制作]注射针是内含玻璃细丝的薄壁毛细吸管，它可以通过毛细管虹吸作用进行载样。用拉针仪（SUTTER,P2000laserbasedmicropipettepuller,具体操作程序详见产品说明书可以把注射针水平或垂直扯下来必须保证制备的毛细管可以进入拉针仪这样加热组件大约在毛细管的中央位置一般用内径为1.0mm的微电极管为材料制作注射针,微电极管可以买到,它与拉针仪是匹配的另外应该对拉针仪的设置进行选择，使细丝温度和扯拉力度(主拉力和次拉力)将处于最佳状态具体需要预实验来确定其最佳设置待用注射针应该用蒸馏水严格清洗以除去残留炭化物颗粒严格的实验微电极管在使用前应经过泡酸泡蒸馏水和硅化的程序,但有人省略了此步也有较好的结果,经拉针仪拉针后就没法清洗,好的拉针仪是不会残留炭化物颗粒,若拉成后清洗其针尖很容易断掉,可用NarishigeJapanmodelPN-30。[持卵管制作]为避免机械损伤持卵管口应该是钝性末端而且其孔隙有限使受精卵轻轻依附在负压管道中这种高度密实可抵抗密封系统的破损而密封可以减少受精卵注射时的旋转运动持卵管的口部应该光滑平整及与其长轴垂直具体制备操作：双手执毛细玻璃管的两端将管的中部置酒精灯外焰烧红至变软后离开火焰同时双手外伸将烧软的部分拉细用玻璃刀或细沙轮小心将细管切开在镜下观察切口应平齐(如不平齐应重新切割)然后于酒精灯火焰底部的蓝焰边缘处将切口钝化处理(即将管口于蓝焰边缘处做短暂灼烧，然后显微镜下检查管口形状，如此反复，直至满意)。如实验室配有持卵管制作仪，则可在显微镜下直接监视热灯丝对持卵管管口灼烧后的形状及时调整二者之间的相对位置更易得到满意的持卵管。持卵管应该做调整，用熔断仪将其打弯使其末端15度(不同的显微注射仪度数可能有差,打弯成25度左右,一般为20-25度)轻微弯曲以方便使用此持卵管为不含细丝的玻璃显微镜下用含刻度目镜确定持卵管的外径应该为100-140?。持卵管的内径很重要,可用铂金灯丝灼烧管口,使其内径为30-50?m左右,内径要能吸住受精卵,管（5。[作]1）点燃酒精灯，调节火焰到最佳。捏持玻璃毛细吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋转过火。2）当吸管开始变软，快速撤离火焰，向外急剧扯拉使吸管变长，形成口径大约200?l的制。3）为做。4）解下(要上)检管。[作]这约1)大使卵胞精要头。[备]注在pH如2在持0：1）将2约m液矿于M2溶达M2溶倒使2。2）覆；定M2溶。3）从用2涤2-3次，调整实验用量，将其置于凹玻片的M2溶液中，调焦使在低倍镜下清楚地看到受精卵的轮廓并且保证受精卵有足够空间自由移动用持卵器将卵汇聚到一起移卵时注意不要将气泡移入，影响操作视野。[显微注射设备]显微注射仪的基本工作原理是运用立体倒置相差显微镜进行观察监测显微镜两侧各置一台显微操作仪一侧接持卵管另一侧接注射针可调节持卵管或注射针的空间位置持卵管通过塑料管连接一个装满矿物油的带微调的注射器通过调节压力控制卵的运动注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪将注射时间与压力固定后进行注射操作操作系统有LEICAASTP基因转殖操作系（marites.d）等体程说格。（3）针内DNA的装载把针头盛射DNA的管通细虹用入注注的该留在DNA溶液到针小这说明DNA溶液完仔注针距米见凹液最载满DNA溶液管持固械待。（4）卵注射受的射相量程显量一致必大复练可。1）置凹片镜倍。2）（X时。3）针见A定A。4）见A。定A。5）生。玻。，，卵。6）原。7）针入，法。8）使A中：①。②，，没易。③换A。④卵射5—0。9）用注。5移（1射1通用7%乙。2，。4）用。图11所个。当所有的卵被负载后再吸取小量气体制成小气泡接着吸取最终容量的工作液气泡将有利于对压力进行调节，更容易使卵移动。5）约5髋浸%侧切口皮肤钝性分离皮下组织移动皮肤直到腹壁神经走行清晰可见这时可看到腹壁下红色卵巢或浅色卵巢脂肪垫。用眼科镊捏住腹壁，并作约0.5厘米横行住畅。6）位。7），。干。8）壶。9）流在，。0）腹。0啃。1。2效。前0应。（2止症导少2处。，持鼠笼温度。正常体温的维持可以缩短动物处于麻醉状态的时间。手术后小鼠常规4-5天观察一次以确保小鼠处于恢复中，清醒小鼠应活动自如。腹腔手术后小鼠有发生肠疝的可能。所以手术时保持切口尽量小，缝合严密，而组织胶水的正确应用可以避免此类并发症的发生。皮肤必须用缝线或不锈刚夹夹闭，手术后1-2周可拔除。如果动状态不，表现厌食，脱水，或