微生物在药学中的应用

第一节抗生素的概念与分类一、抗生素的概念抗生素：由某些微生物在生活过程中产生的，对某些其他病原微生物具有抑制或杀灭作用的一类化学物质青霉菌——青霉素（弗莱明）；灰色链丝菌——链霉素由于最初发现的一些抗生素主要对细菌有杀灭作用，所以一度将抗生素称为抗菌素陆续出现了抗病毒、抗衣原体、抗支原体，甚至抗肿瘤的抗生素现代抗生素的定义：由某些微生物产生的化学物质，能抑制微生物和其他细胞增殖本文档共95页；当前第1页；编辑于星期二\1点39分医用抗生素的特点差异毒力大对作用对象与对机体的毒性之间的差异越大越好由作用机制决定生物活性强、有不同的抗菌谱生物活性用MIC来表示，其值越小表示作用越强能抑制或杀灭的微生物范围称为抑菌谱，有广谱和窄谱之分本文档共95页；当前第2页；编辑于星期二\1点39分本文档共95页；当前第3页；编辑于星期二\1点39分二、抗生素的分类根据产生来源分细菌产：少，有多粘菌素、短杆菌肽等放线菌产：多，链霉素更主要真菌产：青霉素，头孢霉素等动物植物产：地衣素，蒜素，鱼素等根据化学结构分Beta-内酰胺环类大环内酯类氨基糖苷类四环素类多肽类本文档共95页；当前第4页；编辑于星期二\1点39分第二节抗生素产生菌的

分离与筛选目前，新抗生素的获得大致有如下途径：1.从自然界分离并筛选新抗生素产生菌。近年来，为了扩大筛选的来源，已从土壤微生物扩展到海洋微生物，从一般常见微生物扩展到极端微生物，又从微生物扩展到植物、海洋生物等。2.改造现有的已知抗生素的产生菌，再经筛选获得新抗生素产生菌。3.从已知的抗生素进行结构改造，经筛选后获得新的半合成抗生素。本文档共95页；当前第5页；编辑于星期二\1点39分4.采用新的筛选方法，如培养超敏细菌以寻找微量的新抗生素，选用新的肿瘤模型，如用鼠肉瘤病毒M（MSV.M）、鸟类粒白细胞血病病毒等来筛选抗肿瘤抗生素。5.采用现代分子生物学技术设计新抗生素。绝大多数抗生素的原始产生菌是从自然界分离筛选而得，因此，下面以传统的分离土壤放线菌为例，简单说明新抗生素产生菌的常规分离和筛选过程。本文档共95页；当前第6页；编辑于星期二\1点39分

一.土壤微生物的分离1.采土2.分离菌株二.筛选所谓筛选是指从大量待筛选放线菌中，尽快地鉴别出极少数有实用价值的抗生素产生菌的实验过程。在新抗生素产生菌的筛选中，应根据筛选目的选择合适的筛选模型和方法。1.筛选模型筛选模型是指筛选工作中所使用的试验菌。2.筛选方法抗菌抗生素一般采用琼脂扩散法。

本文档共95页；当前第7页；编辑于星期二\1点39分三.早期鉴别1.抗生素产生菌的鉴别2.抗生素的鉴别四.分离精制五.临床前试验研究六.临床试验本文档共95页；当前第8页；编辑于星期二\1点39分第三节抗生素的制备

一.发酵阶段（一）现代胆色素发酵的一般特点1.需氧发酵2.深层发酵3.纯种发酵

本文档共95页；当前第9页；编辑于星期二\1点39分

（二）一般生产流程

1.孢子制备

2.种子制备3.发酵

（1）无菌操作（2）营养需要（3）PH（4）温度（5）前体（6）通气、搅拌及消沫（7）发酵终点判断本文档共95页；当前第10页；编辑于星期二\1点39分二.发酵液预处理及提取阶段（一）发酵液预处理（二）提取常用的提取法主要有以下几类。1.容媒萃取法2.离子交换法3.沉淀法4.吸附法本文档共95页；当前第11页；编辑于星期二\1点39分本文档共95页；当前第12页；编辑于星期二\1点39分援助古巴可拆卸式中试发酵车间

本文档共95页；当前第13页；编辑于星期二\1点39分大连翔大科技股份有限公司中试及大规模生产发酵车间

本文档共95页；当前第14页；编辑于星期二\1点39分山东胜利股份有限公司生物工程技术中心生物农药中试发酵车间

本文档共95页；当前第15页；编辑于星期二\1点39分华中农大中试发酵车间

本文档共95页；当前第16页；编辑于星期二\1点39分内蒙古华蒙金河生物技术有限公司(饲料用抗生素——金霉素，西部开发项目)

本文档共95页；当前第17页；编辑于星期二\1点39分上海联合赛尔生物工程公司国家一类新药霍乱疫苗发酵生产车间

本文档共95页；当前第18页；编辑于星期二\1点39分第四节抗生素的生物合成机制一.次级代谢产物的概念所谓次级代谢产物（secondarymetabalites）是指那些由微生物合成的，但对微生物的生长、繁殖无明显功能的各种代谢产物，如抗生素等。次级产物有以下几个特点。1.对微生物的生长、繁殖无明显功能。2.与初级代谢产物紧密相联。3.在一定条件下能大量合成。

本文档共95页；当前第19页；编辑于星期二\1点39分二、抗生素生物合成的代谢途径大致步骤：营养物质—￫初级代谢中间物—￫前体—￫修饰重排—合成途径—￫抗生素有关代谢途径脂肪酸代谢氨基酸代谢嘌呤嘧啶代谢糖代谢芳香族合成一碳甲基库本文档共95页；当前第20页；编辑于星期二\1点39分三、青霉素的生物合成及调控6-APA本文档共95页；当前第21页；编辑于星期二\1点39分生物合成的调控赖氨酸的反馈抑制糖分解产物的阻抑作用葡萄糖分解产物￫抑制酰基转移酶￫抑制青霉素合成乳糖不抑制，但成本高生产中用滴加或间隙补加以维持低浓度糖本文档共95页；当前第22页；编辑于星期二\1点39分第五节抗生素的主要作用机制本文档共95页；当前第23页；编辑于星期二\1点39分本文档共95页；当前第24页；编辑于星期二\1点39分1、抑制细胞壁的合成青霉素类抑制细胞壁肽聚糖的交叉连结→细胞壁缺损→水分内渗→细菌膨胀变形→细菌破裂、溶解。环丝氨酸：抑制五肽的形成万古霉素和杆菌肽：前者阻断二糖五肽与胞壁受体结合；后者影响内脂循环Bata内酰胺类抗生素：抑制合成交联中所需的转肽酶反应，使不能形成三维结构本文档共95页；当前第25页；编辑于星期二\1点39分2、影响胞浆膜通透性多粘菌素与细胞膜内磷酯结合→细胞膜通透性↑→细胞内重要物质外漏→细菌死亡。制霉素、二性霉素B：与真菌细胞膜麦角固醇结合→形成孔道→细胞内重要物质外漏→真菌死亡。本文档共95页；当前第26页；编辑于星期二\1点39分3、抑制蛋白质合成氨基甙类：〔1〕抑核蛋白体70S始动复合物的生成〔2〕与核蛋白体30S的P10蛋白结合→翻译错误。〔3〕阻止释放因子与核糖体结合抑制蛋白质的释放抗菌药不影响人蛋白质的合成因人与细菌的核蛋白体不同。细菌：70S（原核细胞）30S50S人：80S（真核细胞）40S60S本文档共95页；当前第27页；编辑于星期二\1点39分4、影响核酸代谢利福平：抑制依赖于DNA的RNA多聚酶，从而抑制的mRNA合成氟喹诺酮类：抑制DNA螺旋酶→抑制DNA复制与mRNA的转录。本文档共95页；当前第28页；编辑于星期二\1点39分5、抗叶酸代谢磺胺类抑制二氢叶酸合成酶，TMP（甲氧苄啶）抑制二氢叶酸还原酶，从而抑制DNA、RNA的合成。本文档共95页；当前第29页；编辑于星期二\1点39分第六节抗药性一、基本概念最小抑菌浓度固有性抗药获得性抗药多重抗药性交叉抗药性赖药性本文档共95页；当前第30页；编辑于星期二\1点39分二、产生的遗传学机制自发突变，药物选择压力抗药基因转移本文档共95页；当前第31页；编辑于星期二\1点39分三、产生的生物化学机制1．产生灭活酶（1）水解酶：b—内酰胺酶水解青霉素或头孢菌素的b－内酰胺环。（2）钝化酶：催化某些基团结合到抗生素的OH、NH2上

，使之失去抗菌活性，如G－杆菌对氨基甙类耐药。本文档共95页；当前第32页；编辑于星期二\1点39分2、改变靶位结构〔1〕药物与靶位亲和力↓：如β－内酰胺类与PBPS结合↓。〔2〕靶位结构改变：

①耐甲氧西林的金葡菌产生PBP2，（MRSA）

②链霉素：P10蛋白改变

③利福平：RNA多聚酶β亚基的改变本文档共95页；当前第33页；编辑于星期二\1点39分3、降低外膜通透性细菌细胞膜存在特异通道与非特异通道，当通道的通透性↓→耐药。（1）细菌孔道蛋白质组成、数目、功能改变：如G－杆菌对氨基甙类耐药。（2）产生新的蛋白质堵塞孔道：如细菌对四环素耐药。本文档共95页；当前第34页；编辑于星期二\1点39分4．通过主动泵出系统清除药物细菌：大肠杆菌、金葡菌、表葡菌、铜绿假单孢菌、空肠弯曲菌等。抗菌药：四环素、氟喹诺酮类、氯霉素、β-内酰胺类等通过主动泵出而耐药。本文档共95页；当前第35页；编辑于星期二\1点39分本文档共95页；当前第36页；编辑于星期二\1点39分5.其它代谢拮抗物↑：如对磺胺类耐药的细菌产生大量的PABA。本文档共95页；当前第37页；编辑于星期二\1点39分耐药性产生的人为原因（1）滥用（2）局部用（3）剂量不足（4）单独用（5）长期用本文档共95页；当前第38页；编辑于星期二\1点39分四、对细菌耐药性的对策合理使用抗菌药1、应用抗菌药要有严格指征2、足量用药、疗程要适当3、治疗慢性病要联合用药4、不要局部用药研制新药加强耐药机制研究本文档共95页；当前第39页；编辑于星期二\1点39分第七节抗生素的效价、单位和效价测定一、抗生素的效价和单位效价：相同条件下检品与标准品的抗菌活性之比值效价=检品抗菌活性

标准品抗菌活性×100%本文档共95页；当前第40页；编辑于星期二\1点39分单位

衡量有效成分的具体尺度，可以各不相同重量单位：抗菌活性部分的重量，非全部盐类成分。如链霉素硫酸盐、土霉素盐酸盐、新生霉素钠（钾）盐类似重量单位：全部盐类成分。如纯金霉素盐酸盐、四环素盐酸盐等，1微克＝1单位重量折算单位：青霉素，以抑制50毫升的金葡菌者为1单位，相当于纯品0.5988微克，则1毫克＝1670单位特定单位：特定批次样品的某一重量为一单位。如某批杆菌肽1mg=55单位，制霉菌素1mg=3000单位本文档共95页；当前第41页；编辑于星期二\1点39分标准品：与商品同质，纯度较高的抗生素，每毫克含一定单位，可作效价测定之标准国际单位：经国际协议，每毫克含一定单位的标准品称国际标准品，其单位称国际单位。国际标准品由WHO的生物检定专家委员会主持，由英国国立生物标准检定所组织标定、保管、分发。国家标准品标示量：标签上的标示量原则上以重量表示，成分不清（如制霉菌素），或照顾用药习惯（青霉素），仍沿用单位表示本文档共95页；当前第42页；编辑于星期二\1点39分二、抗生素效价的微生物学测定法抗生素效价的生物测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。管碟法是扩散法中的一种，本法是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液与未知浓度的样品溶液在含有敏感性试验菌的琼脂表面进行扩散渗透，比较两者对被试菌的抑菌作用，求出抑菌圈的大小，以测定抗生素的浓度。在一定范围内，浓度与抑菌圈直径在双周半对数表上（浓度为对数值，抑菌圈直径为数字值）成直线函数的关系，由此绘制成标准曲线，从样品的抑菌圈大小可在标准曲线上求得其效价。由于本法是利用抗生素抑制敏感细菌的特点，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度也很高，不需特殊设备，故一般实验室及生产上多采用此法。但此法也有缺点，即操作步骤多，手续繁杂，培养时间长、得出结果慢。尽管如此，由于它有上述的独特优点而被世界各国所公认，成为国际通用的方法被列入各国药典法规的范围内。本文档共95页；当前第43页；编辑于星期二\1点39分测定方法：一剂量法二剂量法三剂量法影响因素本文档共95页；当前第44页；编辑于星期二\1点39分第十八章微生物在其他药物生产中的应用本文档共95页；当前第45页；编辑于星期二\1点39分第一节维生素一、维生素C化学合成法——莱氏法，国外用生物合成——二步发酵法，中国用1、D-葡萄糖——D-山梨醇——L-山梨糖：弱氧化醋杆菌2、L-山梨糖——2-KLG：大小菌本文档共95页；当前第46页；编辑于星期二\1点39分本文档共95页；当前第47页；编辑于星期二\1点39分二、维生素B2棉病囊霉：4000～8000毫克/升阿舒假囊酵母：4000毫克/升三、维生素B12肝脏提取化学合成丙酸杆菌成本太高，不适宜工业化生产本文档共95页；当前第48页；编辑于星期二\1点39分第二节氨基酸谷氨酸发酵我国的菌株：北京棒状杆菌；钝齿棒状杆菌生物素：过少，菌不长；过多则为乳酸发酵氧：充足时谷氨酸发酵；不足时乳酸发酵NH4+：适量时谷氨酸发酵；不足时生成a-酮戊二酸；过量时生成谷氨酰氨pH中性和偏碱性时生成谷氨酸；酸性时生成乙酰谷氨酰氨本文档共95页；当前第49页；编辑于星期二\1点39分2、赖氨酸高丝氨酸营养缺陷兼抗性突变株赖氨酸天冬氨酸激酶本文档共95页；当前第50页；编辑于星期二\1点39分第三节酶及酶抑制剂酶：有催化作用的蛋白质，新陈代谢必不可少的催化剂酶的用途治疗疾病诊断试剂生物工具酶本文档共95页；当前第51页；编辑于星期二\1点39分一、酶制剂临床上较常用的微生物酶链激酶、链道酶：心血管病治疗。链球菌生产透明质酸酶：治心肌梗死。从动物血浆及动物毒液中提取天冬氨酰胺酶：治疗白血病、肿瘤。许多菌均可青霉素酶：含青霉素制剂的无菌检测工业上较常用的微生物酶：青霉素酰化酶分解青霉素，得到6-氨基青霉烷酸(6–APA)，是半合成青霉素的母核本文档共95页；当前第52页；编辑于星期二\1点39分二、酶抑制剂为具有生物活性的小分子化合物中和抑制或竞争抑制某些酶的活性调节代谢活动：防病、治病如链霉产生的泛诞菌素，抑制淀粉酶，防止肥胖症、糖尿病等本文档共95页；当前第53页；编辑于星期二\1点39分第四节甾体化合物的生物转化甾体化合物具有机体调节作用，可用于治病：肾上腺皮质激素治疗或缓解胶原性疾病、过敏性休克性激素：治疗性器官功能衰退与某些妇科疾病乳腺癌、前列腺癌的辅助治疗药物口服避孕药的主要成分本文档共95页；当前第54页；编辑于星期二\1点39分微生物转化载体化合物的反应类型羟化反应本文档共95页；当前第55页；编辑于星期二\1点39分2、环氧化反应本文档共95页；当前第56页；编辑于星期二\1点39分3、脱氢反应本文档共95页；当前第57页；编辑于星期二\1点39分4、侧链的降解？本文档共95页；当前第58页；编辑于星期二\1点39分微生物生产甾体化合物的方法：单相发酵法双相发酵法固定化酶法转化者培养好的微生物分离后的菌悬液固定化酶或细胞提取底物菌体与培养液菌体与液体过柱液优缺点发酵易、提取难发酵繁、提取易发酵繁、提取易本文档共95页；当前第59页；编辑于星期二\1点39分第五节其他微生物制剂核酸类药物生物碱微生态制剂螺旋藻基因工程产品本文档共95页；当前第60页；编辑于星期二\1点39分本文档共95页；当前第61页；编辑于星期二\1点39分微生物与药物变质本文档共95页；当前第62页；编辑于星期二\1点39分药物中微生物的来源1.空气细菌、霉菌、酵母菌无菌操作区－每1000升空气中<10个细菌。2.水3.其它原料、容器、设备、操作人员、包装材料。本文档共95页；当前第63页；编辑于星期二\1点39分微生物引起的药物变质1.药物变质的判断（1）有病原微生物存在（2）存在微生物的毒性代谢产物（3）产品发生可被觉察的物理或化学变化（4）口服及外用药物的微生物总数超标（5）无菌制剂中发现有微生物存在本文档共95页；当前第64页；编辑于星期二\1点39分2.药物变质的结果（1）变质的药品引起感染（2）药物理化性质的改变引起药物失效（3）药物中的微生物产生有毒的代谢产物本文档共95页；当前第65页；编辑于星期二\1点39分3.影响药物变质的因素污染量营养因素含水量pH值储藏温度本文档共95页；当前第66页；编辑于星期二\1点39分防止微生物污染药物的措施1.加强药品生产管理（GoodManufacturingPractice)交叉污染容器贴错标签2.进行微生物学检验3.使用合格的防腐剂本文档共95页；当前第67页；编辑于星期二\1点39分药物的体外抗菌试验用于抗菌药物的筛选提取过程中的追踪抗菌谱的测定药物含量的测定药物血浓度测定药物敏感试验等包括抑菌试验和杀菌试验两者并非绝对本文档共95页；当前第68页；编辑于星期二\1点39分体外抑菌试验一、连续稀释法

可用于测定药物的最低抑菌浓度（minimalinhibitoryconcentration)和最低杀菌浓度（minimalbactericidalconcentration).本文档共95页；当前第69页；编辑于星期二\1点39分一、连续稀释法21.液体培养基连续稀释法2.固体培养基连续稀释法——平板法可同时测定大批量试验菌株的MIC，且不受药物颜色及混浊度的影响。本文档共95页；当前第70页；编辑于星期二\1点39分本文档共95页；当前第71页；编辑于星期二\1点39分MIC检测方法1.药液稀释：对倍稀释法共14管，12管为空白对照（不加菌液），13管为阳性对照（不加药物）。14管为稀释剂或助溶剂对照（浓度与1管相同）。2.加入菌液0.1毫升（1000～100000个细菌），摇匀。3.培养：37度，16～24小时。4.MIC的确定：试验管呈现澄明的最低药物浓度即为MIC。本文档共95页；当前第72页；编辑于星期二\1点39分二、琼脂扩散法1.滤纸片法新药的初筛及临床的药敏试验2.打孔法药物血浓度的检测3.挖沟法一种药物对几种试验菌的抗菌作用本文档共95页；当前第73页；编辑于星期二\1点39分体外杀菌试验最低杀菌浓度（MBC）也可称之为最低致死浓度（MLC)。取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别移种于另一无菌平板上，培养后平板上无菌生长（或少于5个菌落）的药物最低浓度为该药的MBC（或MLC）。本文档共95页；当前第74页；编辑于星期二\1点39分联合抗菌试验两种抗菌药物、药物与不同pH、药物与不同离子溶液的相互影响。1.协同－加强作用2.拮抗－减弱作用3.无关－相互无影响4.累加－作用为二者之和本文档共95页；当前第75页；编辑于星期二\1点39分一、纸条试验在已接种试验菌的平板表面垂直放置两条各浸有一种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱或无影响来判断它们在联合应用时的效应。本文档共95页；当前第76页；编辑于星期二\1点39分二、棋盘格法A药各稀释度按纵行定量加入各管。B药各稀释度按横排定量加入各管。加入定量菌液，经培养后观察结果。两药同时检测单独MIC。FIC（A）＝A药与B药联合试验时A药的MICA药单独试验时的MICFIC为部分抑菌浓度本文档共95页；当前第77页；编辑于星期二\1点39分FIC（B）＝B药与A药联合试验时B药的MICB药单独试验时的MICFIC指数＝FIC(A)+FIC(B)

<0.75－协同1－累加1～2－无关

>2－拮抗本文档共95页；当前第78页；编辑于星期二\1点39分体外抗菌试验的影响因素1.试验菌标准菌株临床新分离菌株2.培养基3.抗菌药物浓度稀释4.对照试验（1）试验菌对照（2）已知药物对照（3）溶剂及稀释液对照本文档共95页；当前第79页；编辑于星期二\1点39分药物制剂的微生物学检查一、无菌制剂的无菌检查各种注射剂（针剂、输液）手术及眼科制剂都必须无活的微生物。1.无菌检查的基本原则采用严格的无菌操作方法，将被检药品置不同培养基内培养，观察有无微生物生长，以判断被检药品是否合格。本文档共95页；当前第80页；编辑于星期二\1点39分2.无菌检查抽样（1）百分数抽样法：每批的2％～5％（2）固定抽样法：2～203.培养基及培养基灵敏度试验无菌试验灵敏度试验：用已知不同菌株做生长试验来监控。菌种有：藤黄八叠球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。本文档共95页；当前第81页；编辑于星期二\1点39分4.阳性对照菌及抑细菌抑真菌试验（1）阳性对照菌液是为供试品做阳性对照试验使用的。其目的是检查阳性菌在加入供试品的培养基中能否生长，以验证供试品有无抑菌活性物质和试验条件是否符合要求。（2）抑细菌抑真菌试验：加供试品的培养管与未加供试品的培养管比较，以判断供试品有无抑菌作用。（如有抑菌作用可加入灭活剂或用薄膜过滤法检测）本文档共95页；当前第82页；编辑于星期二\1点39分5.检查法（1）直接接种法：适用于非抗菌作用的供试品。（2）薄膜过滤法：适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。本文档共95页；当前第83页；编辑于星期二\1点39分特殊药品的无菌检查法油类药物的无菌检查供试品中加入1％～3％聚山梨酸80（吐温80），其作用是使油类药物均匀分散，便于检出微生物。

本文档共95页；当前第84页；编辑于星期二\1点39分细菌总数的测定本文档共95页；当前第85页；编辑于星期二\1点39分口服药及外用药的微生物学检查需要限制性控制微生物的数量和种类。1.细菌总数、霉菌总数低于规定限量（细菌总数1克或1毫升不超过10～104CFU,真菌数1克或1毫升不超过10～103CFU)。2.口服药物不得检出大肠埃希菌、沙门菌。3.外用药不得检出铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、破伤风梭菌。4.不得检出活螨（含糖的剂型应重点检查）。本文档共95页；当前第86页；编辑于星期二\1点39分平板菌落计数法限制条件1.菌落形成单位（colonyformingunits,CFU）为计数单位。一个菌落就是一个菌落形成单位，它可以由一个也可以由多个菌细胞形成。2.受特定培养基和培养条件限制普通培养基，需氧或兼性厌氧，30～35度，48小时。3.有繁殖能力的菌细胞才能被认定“活菌”。本文档共95页；当前第87页；编辑于星期二\1点39分平板菌落计数法方法1.试验前的准备2.供试品取样、供试液的制备（10毫升或10克加入稀释剂成1：10供试液）3.供试液的稀释（10倍递增稀释法）1:10，1:102,1:103三级4.注平皿（每级1毫升＋15毫升培养基）5.培养：30～35℃，48小时6.菌落数（30～300）乘以稀释倍数为结果7.不合格应复试本文档共95页；当前第88页；编辑于星期二\1