激光照射联合复合多糖对荷瘤小鼠瘤增殖的影响

激光照射联合复合多糖对荷瘤小鼠瘤增殖的影响

［摘要］目的探讨低能量激光照射联合龙葵多糖对荷肝癌小鼠肿瘤增殖的影响。方法建立荷肝癌小鼠皮下种植瘤模型，将荷瘤小鼠随机分为5组，连续治疗10天后将小鼠处死。原位杂交法检测瘤组织血管内皮生长因子mRNA表达；免疫组化法检测瘤组织中细胞增殖核抗原Ki67的表达。结果低能量激光照射联合龙葵多糖可以抑制肿瘤细胞增殖及血管生成，显着下调VEGFmRNA、Ki67的表达。结论低能量激光照射联合龙葵多糖能抑制肿瘤细胞的增殖及血管生成、抑制荷肝癌小鼠肿瘤的生长。

［关键词］低能量激光照射；龙葵多糖；增殖

Effectsoflaserirradiationsolanumnigtumpolysaccharideontumorgrowthincancerloadedmice

［Abstract］ObjectiveTostudyeffectsoflowenergylaserirradiationcombinedsolanumnigtumpolysaccaridesontumorgrowthinlivercancerloadedEstablishedlivercancerloadedmousemodelanddividedrandomlymiceintofivecalculatedthetumorinhibitoryrateandspleendetectedtheexpressionofVEGFmRNAbyinsituhybridizationandKi67proteinbyimmuneLowenergylaserirradiationcombinedsolanumnigtumpolysaccharidecouldinhibittumorgrowthandangiogenesis，theexpressionofVEGFmRNA，Ki67proteinwereLowenergylaserirradiationcombinedsolanumnigtumpolysaccharidecanobviouslyinhibittheproliferationoflivercancercellsandangiogenesis，soinhibitthegrowthofthelivercancerinmice.

［Keywords］lowenergylaserirradiation；solanumnigtumpolysaccharide；cellsproliferation

本实验用低能量激光照射联合龙葵多糖来治疗荷瘤小鼠，观察其对肿瘤细胞增殖及血管生成的影响，以期探讨低能量激光照射联合龙葵多糖抑瘤作用的机制。

1材料与方法

实验材料

实验药物的配制龙葵多糖：用纯度为100%的龙葵多糖200mg溶于生理盐水50ml中，过滤除菌，4℃保存。5-氟尿嘧啶：g/10ml，南通制药总厂生产。

细胞株肝癌细胞H-22由北京大学肿瘤研究所引进。

实验动物昆明种小鼠50只，内蒙古大学动物实验中心购买。鼠龄为4~5wk，体重18~22g，雌雄各半。

实验方法

肝癌细胞系复苏培养将肝癌细胞H-22复苏，收集细胞放入生理盐水1ml中混匀，并等分两份，取2只小鼠，每只腹腔注射肝癌细胞ml进行培养，1周后取小鼠腹水制备模型。

制备小鼠皮下荷瘤模型取肝癌小鼠腹水约10ml，用生理盐水按1∶2稀释成细胞悬液，调节细胞浓度为×107个/ml，按ml/只接种于小鼠右腋皮下，将50只小鼠随机分为五组。NS组：ml/(只·天)灌胃。低能量激光照射组：激光照射小鼠10min/(只·天)、剂量J/龙葵多糖组：2mg/ml/(只·天)灌胃。(4)低能量激光照射联合龙葵多糖组：激光照射小鼠10min/(只·天)、剂量J/(cm2·只·天)、龙葵多糖2mg/5-FU组：mg/、组用激光照射小鼠脾区(脱毛)，激光照射距离30cm，每日1次，每次照射10min，同时各药物组相应灌胃给药，照射、给药10次结束后24h处死小鼠。

病理组织学观察处死荷瘤鼠后30min内取瘤组织、脾脏等脏器，10%中性甲醛固定后，常规石蜡包埋，5μm切片，HE染色，光学显微镜下低倍、高倍观察。

原位杂交法检测瘤细胞VEGFmRNA表达采用VEGFmRNA原位杂交试剂盒，检测瘤组织VEGFmRNA表达。

免疫组化法检测瘤组织Ki67抗原表达采用免疫组化S-P法检测。按照试剂盒说明书进行操作。

统计学方法实验数据应用SPSS软件统计，多组间比较采用方差分析，组间两两比较用q检验。

2结果

肿瘤组织切片光镜观察NS组肿瘤细胞数增多，呈异质性，核大深染，出现较多核分裂象，可见血管形成增多。激光照射联合龙葵多糖组瘤细胞减少，细胞体积缩小，有较多的核固缩，淋巴细胞浸润，血管形成明显减少。

原位杂交法检测瘤细胞VEGFmRNA的表达VEGFmRNA阳性反应胞浆呈棕黄色。图像分析系统对各组瘤细胞VEGFmRNA表达进行平均灰度值统计。结果显示激光照射联合龙葵多糖组较NS组明显减弱，联合组与激光照射组、龙葵多糖组相比也有所减弱。见表1。表1瘤细胞中VEGFmRNA阳性表达的平均灰度值统计

注：与NS组相比，▲P＜；与激光联合龙葵多糖组相比，●P＜

免疫组化法检测瘤细胞Ki67表达计数采用Ki67指数［1］，即每个标本低倍镜(×100)下观察，选择5个视野;高倍镜(×400)下每个视野选取200个肿瘤细胞，计算其阳性细胞总数。Ki67阳性为细胞核染色呈棕黄色，阴性对照片无棕黄色着色。实验组与NS组相比Ki67值明显减少，联合组与龙葵多糖组、激光照射组相比也明显减少。见表2。表2各组小鼠肿瘤细胞Ki67指数

注：与生理盐水组比较，▲P＜；与激光联合龙葵多糖组比较，●P＜

3讨论

激光照射部位越接近免疫器官，或该处神经组织越密集，对机体免疫功能影响就越为明显［2］。从龙葵中提取的抗癌活性物质龙葵多糖有较好的抑瘤作用，本研究应用龙葵多糖与激光的生物学疗法联合作用来提高抗肿瘤效果。肿瘤血管形成在肿瘤的演化过程中起着非常重要的作用，肿瘤通过血管从宿主获得丰富的营养和氧，并通过血管向宿主输送大量恶性细胞，导致肿瘤的不断生长和转移，因此肿瘤血管新生是恶性肿瘤生长和转移的前提。在较多诱导实体肿瘤血管生长的因子中，血管内皮生长因子被认为是最重要的血管形成因子，也是高度特异和高效的血管调控因子，多种实体瘤细胞分泌VEGF，诱导肿瘤血管形成，与肿瘤的生长、转移密切相关［3］。VEGF是一种多功能细胞因子，能选择性地作用于血管内皮细胞膜上的两种酪氨酸激酶受体，具有促进内皮细胞分裂、增殖和血管构建的作用，能够提高微血管对大分子物质的通透性，诱导内皮细胞产生蛋白溶酶、诱导间质胶原酶和组织因子的表达，改变细胞外基质，使其更易于血管的生长［4］。本实验结果表明低能量激光照射联合龙葵多糖可以抑制肿瘤细胞中VEGF的生成，导致血管生成的环节受到抑制，肿瘤组织血管生成减少，阻断肿瘤生长所需营养，抑制肿瘤细胞生长、侵袭、转移。细胞增殖抗原Ki67是目前应用最广泛的增殖细胞标记抗原之一，是和细胞周期相关的增殖细胞核抗原，表达于细胞核内，能很好地反映细胞增殖活性，其检测结果较半衰期较长的PCNA更准确［5］。本实验结果表明未给予任何抗癌药物的NS组瘤细胞Ki67表达增强，细胞增殖活性增高，瘤组织增殖旺盛。激光照射联合多糖组瘤细胞Ki67表达减弱，瘤细胞增殖受到抑制，导致肿瘤的生长被抑制。总之，低能量激光照射联合龙葵多糖能够减少肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞增殖。关于激光和龙葵多糖抑瘤作用的研究还不够深入，许多问题还有待于进一步研究。［参考文献］

1NolteM，WernerM，NasarekA，etofproliferationassociatedantigensanddetectionofnumericalchromosomeaberrationsinprimaryhumanlivertumors:relevancetotumorcharacteristicsandCliPathol，1998，51(1):47-51.

2高美华，李武修，冯献启，等.激光照射对荷瘤小鼠淋巴细胞活性的影响.中国激光，2002，4：381-382.

3SengerframeworkforJPathol，1996，149:1-10.

4YoshijiH，KuriyamaS，HicklinDJ，etvascularendothelialgrowthfact