实验二细菌的染色和细菌细胞构造的观察

实验二细菌的染色和细菌细胞构造的观察

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目的要求染色剂和染色的原理实验材料实验程序思考题目的要求学习微生物涂片掌握细菌的一般染色法和革兰氏染色进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术观察和识别细菌细胞的特殊构造染色剂和染色原理借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等;

化学因素：正负离子之间的相互吸引等。细菌的等电点较低，pH值大约在2-5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷；而碱性染料电离时染料离子带正电荷。因此，带负电荷的细菌常和带正电荷的碱性染料进行结合。

微生物染色的基本原理各种染料的特性与用途革兰氏染色原理细菌细胞电镜照片-----外层为细胞壁革兰氏阳性和阴性菌细胞壁比较革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌革兰氏阳性细菌细胞壁组成革兰氏阴性细菌细胞壁组成实验材料涂片染色用的细菌培养物大肠杆菌（Escherichiacoli)24h的斜面培养物

枯草杆菌（Bacillussubtilis)12-16h的斜面培养物载玻片、接种环、镊子、酒精灯、各种染色液、火柴、无菌牙签、玻璃铅笔、蒸馏水。显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等。示范片

苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）的芽孢；

胶质芽孢杆菌（Bacillusmucillaginosus）的荚膜；

枯草芽孢杆菌的鞭毛。实验程序涂片---干燥---固定---染色---水洗---干燥---镜检

该法可观察微生物大小、形状和细胞排列状况，但不能鉴别微生物的特殊构造等。

简单染色法(各人取牙垢或指甲垢制片观察

)

凡是被染上颜色，且具有典型的球状、杆状或螺旋状的目视物都可视为细菌。实验程序从大肠杆菌和金黄色葡萄球菌斜面中挑取菌苔时必须遵循无菌操作规程。

无菌操作革兰氏染色1.

涂片2.初染：涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至无紫色3.媒染：用路哥氏碘液冲去残水，并覆盖涂面1min，水洗。4.脱色：除去残水后，滴加95%酒精脱色约30s，水洗。5.复染：滴加番红染色液，染1min，水洗后用吸水纸吸干。6.

镜检：观察染色结果并绘图。染色结果金黄色葡萄球菌大肠杆菌荚膜染色的方法和步骤1.涂片：取斜面培养72h左右的胶质芽孢杆菌涂片，自然干燥，自然固定。2.染色：在已自然晾干的涂面上，滴加1%结晶紫染色液染色2min，以20%硫酸铜冲洗数次，再用自来水冲洗1次，晾干。3.镜检：油镜观察示范片并绘图(菌体红色，荚膜无色)。

荚膜薄，易变形，因此在涂片过程中不能用加热固定。芽孢染色的方法和步骤1.涂片：培养24h的枯草芽孢杆菌进行涂片、干燥、固定，操作方法同简单染色法。2.染色：在涂面上铺一层滤纸，在滤纸上滴加孔雀绿染色液，使滤纸片湿润，放在水浴锅上以蒸汽加热（或用酒精灯加热至冒蒸汽而不沸腾），不断添加孔雀绿染色液，在冒蒸汽的条件下染色10min，切勿使涂面干涸，也勿使染液沸腾，冷却后水洗至无绿色流出为止，再用番红染色液复染1min，水洗并风干后镜检。3.镜检：油镜下观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色鞭毛染色的方法和步骤菌液的制备及涂片:(菌种应预先连续传代5-6代)1.接种：先在斜面底部加入0.5-1mL无菌水，取活化的枯草杆菌1-2环菌苔，接种于无菌水中，300C培养15-18h。2.制备菌液：挑取斜面底部近水面处菌苔数环，移入1mL与菌种同温的无菌水中，280C温箱保温10min。3.鞭毛涂片：先用悬滴法观察其运动性，若运动性很强，即可涂片。涂片后自然干燥、固定。染色：染色液必须新配制，涂片必须充分晾干才能染色。1.

先用刚过滤的鞭毛染色液A染7.5-8min左右。2.倾去A液，再加鞭毛染色液B液染3-5min，水洗，自然干燥。3.

用c液石炭酸复红复染2min，水洗、晾干、镜检。油镜下观察鞭毛的数目及着生情况