基因芯片潘丽华

1.什么是基因芯片

生物芯片，将大量生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特意性亲和反应，如核酸杂交反应，抗原抗体反应等来分析各种生物分子存在的量的一种技术。基因芯片（genechip），又称DNA微阵列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息。当前第1页\共有25页\编于星期四\21点五十年代DNA分子结构和半保留复制模型的建立六十年代基因编码的确定七十年代限定性内切酶的发现和DNA重组技术的建立八十年代PCR的发明九十年代人类基因组计划的实施2.基因芯片的诞生当前第2页\共有25页\编于星期四\21点生物科学正迅速地演变为一门信息科学。我们正由结构基因组时代迈入功能基因组时代。随着这个功能基因组学问题的提出（后基因组时代，蛋白组学），涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具，最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳（2-D-gel）（及相应的质谱法测蛋白分子量）和基因芯片（Genechip）技术分子生物学的发展推动了基因的研究当前第3页\共有25页\编于星期四\21点美国继开展人类基因组计划以后，于1998年正式启动基因芯片计划，美国国立卫生部、能源部、商业部、司法部、国防部、中央情报局等均参与了此项目。同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分国立实验室如ArgonneOakridge也参与了该项目的研究和开发。英国剑桥大学、欧亚公司正在从事该领域的研究。世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣，都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。目前全世界有几百家基因芯片公司，有多种生物芯片问世，而且这些芯片的特点较以前密度更高，检测方法更精确，特异性更强的特点。而主要仍以少数几家公司为主，如Affymetrix、Brax、Hysep等。国内目前主要如清华大学（程京）、中科院生命科学院、上海复旦大学、北京军事医学科学院、南京东南大学、西安等四十余家公司，而且可能还有一大批公司相继成立。当前第4页\共有25页\编于星期四\21点基因芯片是信息时代的产物生命科学、物理学、计算机科学、微电子技术光电技术、材料科学等现代高科技当前第5页\共有25页\编于星期四\21点3.基因芯片的分类根据探针的类型和长度，基因芯片可分为两类。其中一类是较长的DNA探针（100mer）芯片这类芯片的探针往往是PCR的产物，通过点样方法将探针固定在芯片上，主要用于RNA的表达分析。另一类是短的寡核苷酸探针芯片其探针长度为25mer左右，一般通过在片（原位）合成方法得到，这类芯片既可用于RNA的表达监控，也可以用于核酸序列分析。当前第6页\共有25页\编于星期四\21点元件型微阵列芯片生物电子芯片凝胶元件微阵列芯片药物控释芯片

通道型微阵列芯片毛细管电泳芯片PCR扩增芯片集成DNA分析芯片毛细管电层析芯片生物传感芯片光学纤维阵列芯片白光干涉谱传感芯片一般基因芯片按其材质和功能，基本可分为以下几类当前第7页\共有25页\编于星期四\21点6400点的基因芯片（面积12X14mm)当前第8页\共有25页\编于星期四\21点核酸杂交技术是基因芯片应用的基础。4.基因芯片的原理当前第9页\共有25页\编于星期四\21点基因芯片的基本原理任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8nt亚序列：当前第10页\共有25页\编于星期四\21点

原理--通过杂交检测信息一组寡核苷酸探针—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由杂交位置确定的一组核酸探针序列GTTAGATC杂交探针组TATGCAATCTAG重组的互补序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC

ATACGTTA当前第11页\共有25页\编于星期四\21点当前第12页\共有25页\编于星期四\21点原位合成直接点样原位光蚀刻合成原位喷印合成

分子印章法针式点样喷墨点样光导原位合成法

基因芯片的制作方式当前第13页\共有25页\编于星期四\21点1、原位光蚀刻合成寡聚核苷酸原位光蚀刻合成技术是由Affymetrix公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的5'羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5'端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含n个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通过32个化学步骤，8个小时可能合成65,536个探针。当前第14页\共有25页\编于星期四\21点2、光导原位合成法当前第15页\共有25页\编于星期四\21点点样法

点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。

采用人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的载玻片上，经一定的化学方法处理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好的DNA芯片可置于缓冲液中保存。用多聚赖氨酸包被固相支待物玻片，经过分区后用计算机控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点上核酸分子，点样量很小，约为5nl。大规模CDNA芯片多采用这种方法，与其寡核苷酸微芯片相比。DNA芯片的潜在优越性是具有更强的亲和势和特异性杂交，但是需要大量制备，纯化，量化，分类PCR产物。当前第16页\共有25页\编于星期四\21点当前第17页\共有25页\编于星期四\21点当前第18页\共有25页\编于星期四\21点基因芯片的应用1.基因功能分析研究2.检测与疾病相关的基因,进而用于疾病诊断3.药物筛选,4.检测基因突变5.其他(环境化学毒物的筛选

\体质医学的研究)当前第19页\共有25页\编于星期四\21点基因功能分析研究将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。当前第20页\共有25页\编于星期四\21点检测与疾病相关的基因,进而用于疾病诊断目前主要涉及：癌症、心血管疾病、血液病、遗传性疾病、神经系统疾病、部分感染性疾病、免疫反应相关性疾病毒物引起的损伤等。当前第21页\共有25页\编于星期四\21点药物筛选

在基因功能研究基础上，特别是确立了与某些疾病相关基因的表达变化情况后，就可针对疾病发生机理进行药物筛选工作。将这些基因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和正常组只在某些药物刺激下这些基因表达的变化，可快速判断药物作用的效果，并进行高通量筛选（highthroughoutscreening），可使新药开发获得技术上的突破。EvanseandRellingScience,286(5439):487,Oct15,1999当前第22页\共有25页\编于星期四\21点基因芯片的发展方向进一步提高探针阵列的集成度，如有多家公司的芯片阵列的集成度已达1.0×105左右，这样基因数量在1.0×105以下的生物体（大多数生物体）的基因表达情况只用一块芯片即可包括。

提高检测的灵敏度和特异性。如检测系统的优化组合和采用高灵敏度的荧光标志。多重检测以提高特异性，减少假阳性。高自动化、方法趋于标准化、简单化，成本降低。价格高昂是目前推广应用的主要障碍之一，但随着技术的革新，基因芯片的价格将会大大降低。当前第23页\共有25页\编于星期四\21点高稳定性。寡核苷酸探针、RNA均不稳定，易受破坏。而肽核酸（PNA）有望取代普通RNA/DNA探针，可以确保探针的高稳定性。研制新的应用芯片，如1999年美国环保局(EPA)组织专家研讨会，讨论了毒理学芯片的发展策略。近来多种新的生物芯片不断问世，这是物理学、