化学专业论文-精氨酸激酶(ak)的提取与纯化本科毕业论文

.466.297.466.242.73120.114.4图4-2过Q-Sepharose的SDS图谱1~7以及9道是经Q-Sepharose洗脱收集的；8、标准蛋白质4.5AK经各步纯化后的SDS电泳图谱如图5-1为细胞破碎离心得到的上清溶液以及通过各步纯化后所得溶液的SDS电泳图。由该图可知，我们经过的纯化策略达到了比较理想的效果。123456如图5-1，AK经各步纯化后的SDS图谱1、标准蛋白2、上清3、盐析4、经过CMC处理的蛋白质5、经过S-100处理的蛋白质6、Q-Sepharose5讨论（1）由于精氨酸激酶基因的菌种是保存甘油中，我们在进行接种扩大培养到含卡纳霉素的LB培养基锥形瓶中，首先要把原菌液接种到含LB培养基的小试管中进行活化8－12小时。由于不同的菌种的生长情况有差异，在加IPTG值的要求不同。根据参考文献得出，诱导AK基因表达最适宜的OD600值为0.6～0.8，另外，我们通过实验得出，IPTG诱导时间为3小时。IPTG终浓度，为0.2（2）由于诱导AK表达的IPTG的浓度较低，小于1mM的情况下，不易产生包涵体，因此，我们在后面的破壁、离心、分别取上清和沉淀，分别用测活和电泳检测，发现沉淀中几乎没有AK。（3）根据参考文献得出，精氨酸激酶活性可以通过测定在575nm处精氨酸激酶1min内的下降值。所用底物主要包括Arginine，Mg(AC)2。观察精氨酸激酶的热力失活曲线知道精氨酸激酶在30℃活性最高，另外pH值的变化对精氨酸激酶的活性影响很大，当pH等于8.2时活性最强。测活时底物的要放在25（4）将粗提的蛋白首先通过CMC阳离子交换层析，将带正电荷的杂蛋白挂于柱子，精氨酸激酶和其它蛋白洗脱出来，由于CMC阳离子交换层析有稀释作用，以及分子筛对上样体积的要求（柱床体积的5％－15%），所以需要浓缩洗脱液，然后通过S-100凝胶过滤层析，再经过Q-Sepharose阴离子交换层析进行进一步纯化，精氨酸激酶能结合于柱子，但是却能挂上大量的杂蛋白，然后用1mol/L的NaCl进行梯度洗脱分部收集得到较纯的精氨酸激酶，由公式计算得NaCl浓度为0.23M时，AK蛋白开始洗脱下来。在这个过程中都要进行测活以及电泳图谱来确定精氨酸激酶的活性和纯度。（5）由电泳图谱可看出经过于S-100凝胶过滤层析分离纯化的效果不是很明显，主要原因是精氨酸激酶（40KD）附近有许多杂蛋白的电泳带，而SephacrylTM—10的分离范围是103－105。这个范围较大，难于把杂蛋白分开。（6）要有好的分离效果要注意层析柱的高度和体积；上样量的大小；洗脱梯度的形状和洗脱体积；洗脱速度；分级物的收集量。参考文献：[1]FranceRM,SellersDSandGrossmanSH.Purificationcharacterizationandhydrodynamicpropertiesofargininekinasefromgulfshimp(Penaeusaztecus).ArchBiochemBiophys,1997,345(1):73-78[2]ZhouG,somasundaramT,blancE,etal.Transitionstatestructureofargininekinase:implicationsforcatalysisofbimolecularreaction.ProoNatlAcadsciUSA,1998,95(15):357-359[3]TsouCL.Configurationalflexibilityofenzymeactivesites.Science,1993,262(5132):380-381[4]潘继承精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究博士学位论文北京：清华大学F2004(4):1-2[5][美]J.萨姆不鲁克D.W.拉萨尔分子克隆科学出版社上册15章（1217－1259）。[6]France,RichardMorris,Ph..DPurificationandphicicalcharacterizationofargininekinasefromPenaeusaztecus:Evidenceforamoltenglobulefoldingintermediate.UnivercityofSouthFlorida,1994(1)[7]YuZ,PanJandZhouH.MAdirectcontinuouspHspectrophotometricassayforargininekinaseactivity.Proteinandpeptideletters,2002.9(6)545-55