第九讲凝胶电泳技术演示文稿

第九讲凝胶电泳技术演示文稿当前第1页\共有44页\编于星期六\16点优选第九讲凝胶电泳技术当前第2页\共有44页\编于星期六\16点

核酸分子杂交技术当前第3页\共有44页\编于星期六\16点

蛋白分子杂交技术当前第4页\共有44页\编于星期六\16点

细胞转化（原核）/转染（真核）当前第5页\共有44页\编于星期六\16点PCR扩增当前第6页\共有44页\编于星期六\16点DNA测序DNA测序仪当前第7页\共有44页\编于星期六\16点

蛋白测序当前第8页\共有44页\编于星期六\16点

文库构建当前第9页\共有44页\编于星期六\16点

酵母双杂交当前第10页\共有44页\编于星期六\16点RNA干扰(RNAi):转录后基因沉默技术当前第11页\共有44页\编于星期六\16点

第一节凝胶电泳技术凝胶电泳（Gelelectrophoresis）

是以凝胶为载体，以电流为驱动，用于分离不同大小、形状、等电点等分子的技术。凝胶电泳通常用于分析用途。但也可以作为制备技术，如在使用质谱(MS)、PCR、克隆、DNA测序、免疫印迹等检测之前用于提纯分子。当前第12页\共有44页\编于星期六\16点一、核酸的凝胶电泳

基本原理

在buffer为PH8.0时，带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定介质（琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。

当前第13页\共有44页\编于星期六\16点电泳槽电泳仪梳子电泳槽制胶板正极电源插孔负极电源插孔电源线电泳槽当前第14页\共有44页\编于星期六\16点当前第15页\共有44页\编于星期六\16点当前第16页\共有44页\编于星期六\16点

电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型

①分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移率要快；

②同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比线性DNA分子要快，线性DNA分子比开环DNA分子要快。

当前第17页\共有44页\编于星期六\16点图2线性DNA电泳图当前第18页\共有44页\编于星期六\16点

凝胶电泳的分辨力：

与凝胶的类型和密度相关

琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间;

聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间当前第19页\共有44页\编于星期六\16点聚丙烯酰胺凝胶电泳图（高分辨率，1bp差异可区分）琼脂糖凝胶电泳图当前第20页\共有44页\编于星期六\16点（一）琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。当前第21页\共有44页\编于星期六\16点LMP琼脂糖熔点：62～65℃

熔解后，在37℃

可保持液态数小时；在25℃

可保持液态约10min

应用：直接酶切，回收DNA分子；在65℃

下将LMP琼脂糖凝胶熔化；加入过量的酚抽提DNA；离心获得含DNA分子的上清液。当前第22页\共有44页\编于星期六\16点琼脂糖凝胶电泳图当前第23页\共有44页\编于星期六\16点琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：1×

TAE或TBE

凝胶的含量：根据检测的DNA大小加DNA样品：<1μg，指示剂电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间染色和观察：溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。能看到0.05

μg的微量DNADNA的片断大小与荧光强度成正比

当前第24页\共有44页\编于星期六\16点TAE:电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。

TBE:缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好（常用）。TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。电泳反冲液当前第25页\共有44页\编于星期六\16点SeparationRangeVs.%Agarose当前第26页\共有44页\编于星期六\16点注意：EB（Ethidiumbromide，溴化乙锭）为强致癌物！！！当前第27页\共有44页\编于星期六\16点Agarosegelelectrophoresis当前第28页\共有44页\编于星期六\16点当前第29页\共有44页\编于星期六\16点当前第30页\共有44页\编于星期六\16点当前第31页\共有44页\编于星期六\16点凝胶成像仪当前第32页\共有44页\编于星期六\16点

用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算

当前第33页\共有44页\编于星期六\16点二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:

1、DNA的分子大小:

线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

当前第34页\共有44页\编于星期六\16点2、琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

当前第35页\共有44页\编于星期六\16点3、DNA分子的构象

当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动快,而线状双链DNA移动要慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。

当前第36页\共有44页\编于星期六\16点4、电源电压

在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。

当前第37页\共有44页\编于星期六\16点5、嵌入染料的存在

荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。

当前第38页\共有44页\编于星期六\16点6、离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

当前第39页\共有44页\编于星期六\16点第二节分子杂交

一

Southern杂交二

Northern杂交三菌落原位杂交四

Western杂交当前第40页\共有44页\编于星期六\16点分子杂交

(moleculehybridization)【分子杂交】是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量大小。根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern杂交和Western杂交，及由此演化的斑点杂交和菌落杂交等。

当前第41页\共有44页\编于星期六\16点分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行，也可能在蛋白质与蛋白质之间进行。【核酸分子杂交】是指核酸分子(DNA或RNA)在变性以后，在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。当前第42页\共有44页\编于星期六\16点当前第43页\共有44页\编于星期六\16点探针标记方法体内(invivo)标记是将放射性标记