利用植物反应器生产药物蛋白及疫苗的进展

植物反应器生产药用蛋白的研究进展李世成现代基因工程技术最初是建立在结构简单的微生物，尤其是以大肠杆菌为受体表达外源蛋白，用植物反应器生产药用蛋白的思路出于偶然。二十世纪八十年代，比利时PGS公司的科学家将一个神经肽（enkephalin，脑啡肽）编码基因转入烟草中表达，用意在于让瘾君子们不用抽烟，只需拿烟叶闻一闻或放在口中嚼一嚼即可过烟瘾，以此减少尼古丁对人体的危害及减少空气污染。他们在这个小肽基因两端设计了两个蛋白酶的酶切位点，将改造后的基因串联导入烟草细胞并成功获得再生植株，结果小肽以多聚体的形式表达存在，用胰蛋白酶和羧肽酶作用后获得了神经肽，每粒种子在200nmol。虽然，他们的目的最终没能达到，因为神经肽要经血液运输而起作用，在口腔及消化道内会被降解掉，但他们却意外地找到了一条利用转基因植物生产药用蛋白的途径，引起人们对此领域的关注。尤其是转基因植物生物反应器的研究和开发使植物能以极低的费用大量生产药用蛋白,具有极大的商业价值。。植物反应器生产药用蛋白的优点利用植物反应器生产药用蛋白已成为制药产业重点开发的热点领域。通过植物基因工程技术，在转基因植物中生产药用蛋白及多肽疫苗，具有微生物或动物反应器不可替代的独特优点（见表1）。它们不仅可以对真核生物蛋白进行准确的糖基化、酰氨化、磷酸化、亚基的正确装配等翻译后加工，使表达产物具有良好的生物活性和较低的免疫原性，而且也不像细菌在发酵过程中那样由于产生不溶聚合物—包涵体，而需要将它们重新溶解并折叠成天然蛋白质，这一过程所需要的成本很高；不仅如此，植物反应器也不会像动物反应器那样含有人类的潜在病原或其他污染等潜在的威胁；另外利用植物反应器，来源广，可进行大量田间栽培；转化植株系的种子易于储存，有利于重组蛋白的生产和运输；投资小，成本低。据推算，利用转基因植物生产药用重组蛋白的成本，仅为利用大肠杆菌发酵生产成本的1／10～1／50。表1微生物、动物和植物反应器的比较撇原核残微生余物反塔应器私植物协反应逗器估动物遥反应棍器岁真核上蛋白陵翻译饮后加筝工的斥能力冲有限通；杏上游轰生产洗成本轿较低葵；墓细胞锻培养采需要仙用胎灵牛血贸清作嚼为生味长培柱养基益，以鱼及从关培养谦上清负中提柳取，吸成本标昂贵马；准细菌域发酵雕常形袖成不沿溶聚玻合物饼或回班收率尘低；商基因敏转化区容易碗、成野功率漏高、由周期屑短、挎表达药量高拼、提止纯容话易、逝收效都快（当少于客两年随）；桂转基袋因动棒物生忽长繁庸殖、摇饲养趁条件暮及营侧养要绸求高焦；愁宿主俊菌的粥表达降药物进种类秒及表虽达量咱有限乏；裕转基你因植遭物自件交后貌得到萝的同沿质后益代的幕遗传观性状联稳定帐；进嫩而在衰植物摄体内蚁积累耻多基落因；判基因连转化踪难度湖大、姜转化井成功应率低馆、生辱产药农物等蝶待周油期长榆（牛责需要脊7年羊，羊愉需要沟3年散）；嗽噬菌守体等墨污染恩造成鲁倒灌应的威帝胁；桐不存趣在噬哲菌体押污染娃造成昌倒灌名的威术胁；伙动物察反应致器的从污染坝问题古；削下游污加工以复杂擦、成芬本高繁；饿发酵需常常薯需庞勤大的锯设备航投资莲。移可食蹲药物罪节省授下游橡加工绝开支粘；检转基棕因动弓物易睬产生炉社会乌和伦著理问呆题。植物反应器生产药用蛋白研究进展近20年来，随着植物基因工程的迅速发展，在植物抗虫、抗病毒和品质改良等方面已取得了举世瞩目的成就，同时利用转基因植物生产药用蛋白等为攻克医药难题也开辟了新的天地。科学家正逐渐把药物的生产从微生物转向植物，在这方面许多国家竞相研究。据不完全统计，目前已有几十种药用蛋白或多肽在植物中成功表达，一些研究机构或公司已开始从这些药物蛋白的生产中获得了巨大经济效益。1、植物抗体自从十几年前转基因烟草成功地表达免疫球蛋白的重链和轻链基因并组装成功以来,植物已经能够生产完整的IgG和IgA分子,分泌型IgG和IgA分子,单链可变区片段(scFv),Fab片段和重链可变区以及双特异性抗体(通过具柔性的肽键接头连接到一起),膜锚定抗体以及嵌合型的IgG和IgA分子等不同类型抗体。应用植物生产单克隆抗体具有极大的市场潜力,获得的价格低廉的单克隆抗体在人类及牲畜的疾病治疗中将发挥巨大的作用。目前已经成功地获得具有潜在医疗价值的植物抗体。主要有转基因烟草生产针对腐蚀牙齿的致病原Sreptpcpccusmutans抗体IgG-IgA、人抗疱疹病毒(antiherpessimplexvirus)的抗体、针对癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA)的抗体、利用植物病毒载体侵染烟草瞬时表达淋巴瘤特异的疫苗等植物抗体全面用于诊断和治疗需要解决的主要问题包括产品的数量和质量、下游纯化工艺、糖基化等。通过调节表达元件、优化密码子以及提高抗体的稳定性可提高表达系统中重组抗体的积累水平。重组蛋白在植物体内的糖基化(glycosylation)方式与在人体内不同，这一问题近年来引起人们的关注，因为不同模式的糖基化会对人体形成免疫原性。一些专门的研究工作就是针对如何消除这种免疫原性的，如在不需要糖基化仍具有抗体活性的情况下，将抗体中有关植物N-糖基化的识别序列去除。对于高尔基体介导的糖基化，只要在抗体的C末端附加内质网滞留信号肽KDEL，就可避免糖基化。另一种非常理想的方法是将植物糖基化方式转变为适合人体的糖基化，如将人的β-1,4-乳糖基转移酶（galactosyltransferase）转化烟草，然后再与表达鼠抗体的烟草杂交，其后代产生的抗体就完全适合于人体了。这有助于消除对植物抗体作为人类药物可能存在免疫原性和致敏性等问题的忧虑。而且人类食物中普遍存在植物糖蛋白,因此对多数人而言,植物抗体的应用不会存在危险。2、口服疫苗转基因植物生产口服疫苗的前景非常诱人。在植物组织内合成某种致病原的关键免疫原性蛋白,然后作为可口服的亚单位疫苗给人和牲畜服用,人或动物的体内就会产生相应的抗体,具有抵抗该致病原的能力。迄今为止,在植物中表达用于疫苗研究的病原基因主要有乙肝疫苗、大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位(LT—B)基因、霍乱弧菌毒素B亚单位(CT—B)基因、Norwalk病毒衣壳蛋白疫苗、猪传染性胃肠炎病毒S糖蛋白(TGEV—S)基因、口蹄疫病毒VP1蛋白(MDV—VP1)基因、狂犬病病毒G蛋白基因、兔出血病病毒(RHDV)VP60蛋白基因等。另外结核杆菌分泌蛋白MPT64基因在胡萝卜中获得了表达,轮状病毒结构蛋白vp4、vp7基因分别在马铃薯中获得了表达。与注射疫苗相比,口服疫苗成本低、便于管理,是一种很有市场前景的大众免疫防护方式。口服疫苗还能够提高黏膜免疫力,提高对通过黏膜表皮进入人体的传染性因子的抵抗能力。目前对于口服疫苗的主要忧虑在于:蛋白质成分在胃肠中的降解是否在引发免疫反应之前。为了防止降解,人们利用重组微生物,脂质体以及转基因植物组织运送这些蛋白质,使这些蛋白质能够完整地到达肠部,引发免疫反应。目前已开发了几种有效的制剂，如生物胶丸。库另外房，衔表达透水平浸一直蜡是关肾注的良焦点骆。炸在现肝有的孩研究妇中秆,队外源完基因彩所表爆达的住重组艇蛋白榴大约崭只占滤植物吊中可法溶性爹蛋白难的皆0址.抢01当%葬～栗0赤.必37折%托,戴即使介以高杏表达推量者除为标莫准源,液此表堵达量牧作为扔疫苗讯仍然可很低约。那恭么如紫何提沉高转果基因胀植物桨的抗属原蛋眠白产辆量乔?水针对粥这一尘问题姓,已解决材方法匪是型通过合对目岩的基疑因的逝修饰斗，如尼附加免先导外序列活和蹦po与ly择（港A律）信以号、咏优化捉密码掌子以循适应棉植物祖系统肺或通炭过转暮基因倡植物沟与各暑种遗腔传背验景杂驼交，望都可掏提高梳表达滔水平秩。慌表达幼产物苏在细惜胞中蛙的定秀位也亡很重俩要，赏关系基到转或译后触加工贷及产注品的粘稳定断性。相对于浸亚单腾位疫块苗而洞言驼,帜适宜蜓表达舰部位位是细篇胞表叼面、溉内质婚网以勇及高绩尔基盖体。郊人们庭还将卸疫苗得基因断与植蒜物病玻毒表哀面蛋名白基哪因融喜合构病成瞬送时表歉达系苦统惩,食也得请到了考较高觉的表何达水腹平。昌还有钱一个醋相关矩的策涌略是菠用来炮抵抗恳自身状免疫柿疾病膨:衫利用驼转基盖因植骄物表困达自吉身抗董原作驶为口哈服疫弦苗暂,劈服用宿较大孕剂量需的自浪身免透疫原胆产生见免疫子耐受望,休进而曾达到体抑制勿自身慰免疫禁疾病席的发零生。霸这一党策略岛已经粒在治忽疗糖资尿病摊的小霞鼠模奏型中之获得盛了成夹功。耗3、朝其他疮蛋白秋质淹生产璃具有馅药学议活性驼的植哥物蛋蚊白和故多肽伤是近坐年来木转基扶因植宵物应宰用的苦另一漫迅速梳发展咐的领展域。烈大量够研究刮表明员，人耍体内党含量崭甚微售但具携有重添要临冶床价鬼值的翼蛋白脾或多币肽也与可在术植物险系统他中表出达。眯如升人生毙长激围素、载人血照清白厚蛋白啦、人左干扰或素熟β碌、人该蛋白隙C滥、讯人表情皮生糕长因闷子、妈红细扁胞生究长素凉、脂风肪酶河、乳慌铁蛋溪白、陶水蛭知素、庸胶原谊蛋白塞等。塑目前闸生产叔实践块中面呈临的雷主要拍问题幅仍是者表达波水平词过低提。熄编码忘人源幼蛋白离质的娃基因穷在植盟物中芦的表犬达量程很低丑:监人血老清白效蛋白匠(h材um翁an底s恨er那um懂a供lb删um折in限)侍占植板物苍TS舍P少的膛0.演0劈20撞%瓜；秧人蛋葵白瓶C(屠hu锻ma斗n镜pr志ot爷ei倚n惹C)顿占耻0.句00虚1%滋；泛红细叔胞生谷成素笛(e车ry粮th源ro汪po纵ie抓ti貌n驰,E呜PO燃)能占凭0.做00抢3杜%辣；面人干授扰素腰β砖(h掏um卷an企i台nt铜er捷fe姨ro传n-根β灿)撑不到笔0.态00扇1纹%(屡鲜重笨)司。人挠工合筋成的亭人表宾皮生舱长因枕子痕(h拜um状an有e帐pi沈de扣rm杨al膛g秩ro金wt枣h粒fa秘ct府or惯)瓦基因垫在转碰基因跳烟草拖中表泳达量概仅达瓣到齿TS峡P壳的校0.酷0搞01卡%扑。蔽一般悟来说邮，在煌临床废应用余中需嘉要纯然化的轧重组朽蛋白塑表达她量应贯占转臂化细冬胞惑TS集P爪的旺1%则以上上时才丢具有错商业例价值猴。因荡此虹,垦真正也用于咐生产肤还需蓬做大巾量工魂作。所为了窜进一塞步提柿高人掠源蛋碧白在愉植物防细胞娱内的亏表达盛水平薪,补人们浩采用喜的策唱略劝:刃(1杏)夫希望印在叶呆绿体蔑内合昂成复竿杂的赔需要泻翻译谎后修缸饰的瓦或亚著基装仇配的洪真核授蛋白倘质铺,代如麦sI蝇gA评分；跟在高避等植号物叶隶绿体葵中表碎达外语源基叼因是吗一种安可供健选择旗的转加基因差体系露。整拳合到攀烟草袍叶绿缺体基级因组简中的北外源悄基因只拷贝执数能寄够达华到每收个细携胞蓝10别00离0合个拷匠贝俱,里相应络的重虎组蛋华白占怖全部秘可溶资性蛋班白的菌比例搂也提血高到闷47疏%牌；家(2增)栏蛋白统质靶厚向定闭位贷:芬重组畜抗体揉不在熊细胞冷质中优而是彩靶向移定位锣在离店质体包(a剂po委pl傅as努t)嫩耳的表危达策谁略明去显提捐高了简重组脱抗体慈的产检量赵；畅靶向晋定位损在内存质网冈的重含组蛋浇白的糠表达允水平碌提高评了没10校～闲10累0划倍壶；皇(书3)辨沉植物负中遗盯传密闻码子烈的使党用频减率与犁动物钞不同沈,贸对外古源基杜因的感一些赵密码贯子进摆行替柿换能数够显华著提的高该害基因燥在植诵物体耐内的偷表达搜水平闸；森(4允)多使用步组织颜特异僚启动驱子和跑病毒已序列姓能够逐提高裹基因组转录静和翻烟译的乌水平宜；颈(5乞)畅在拟堆南芥选中生好产豆寇类剪ar尤ce嫁li虑n颠,兵同时槽表达污种子烂储存伙蛋白息清蛋列白或(a膜lb羡um连in护)扬2S管忆的反技义基症因许,灶结果每使得篇ar销ce定li辟n局的表耕达量河达到收种子饺总蛋众白的喇24会%,洁利用锹相似熊的策咳略有黑助于捕显著躬提高寻目标嫌蛋白义的表护达水冲平。害药乓用豪蛋白酱的表恶达策慨略锐在植烤物中跳生产钻药物择蛋白站主要遵通过细两个旦途径趣：第侨一条墓途径柜是利脑用土出壤杆宇菌或膏农杆轨菌属竞（A屡gr币ob瓦ac瘦te牲ri淹um走）介株导转掌化法萍、粒果子轰贡击法板或其圣他标碰准转转化技宿术，优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