试谈DNA重组技术的基本工具

DNA重组技术的基本工具复习：DNA分子的结构：（磷酸二酯键）基因概念：基因在染色体上排列特点：基因的功能：基因的结构：基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出符合人们需要的新的生物类型和生物产品。又叫做DNA重组技术。（一）基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程实质（原理）结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平定向地改造生物的遗传性状，产生人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达基因重组一种限制酶只能识别一种特定脱氧核苷酸序列；并在特定位点切割。一.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”（二）基因工程的基本工具1、来源：2、种类：3、作用：主要是原核生物4000种。4、作用实质：断开磷酸二酯键5、结果：形成两种末端粘性末端平末端ＥcoRI限制酶SmaI限制酶识别序列－ＣＣＣＧＧＧ－切割位点Ｇ和Ａ之间Ｃ和Ｇ之间未端类型平末端粘性末端－ＣＴＴＡＡＧ－－ＧＧＧＣＣＣ－－ＧＡＡＴＴＣ－要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。

被同一种限制酶切断的几个来源不同的DNA是否具有相同的黏性末端？两个不同的ＤＮＡ的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。被同一种限制酶切断的几个DNA具有相同的黏性末端。二.DNA连接酶——“分子缝合针”1.作用：把两条ＤＮＡ末端之间的缝隙“缝合”起来，恢复断开了的磷酸二酯键。2.来源大肠杆菌中分离的E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端T4噬菌体中提取的T4DNA连接酶两种末端都可以连接3.DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同和不同点？（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。三、基因进入受体细胞的载体——”分子运输车”１、作用：将外源基因导入受体细胞２、特点（条件）1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存2、有适宜的限制性内切酶酶切位点，最好是对多种限制性内切酶有单一切点3、具有标记基因，便于进行筛选4.对受体细胞无害３、常用的运载体：质粒（最常用）、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等质粒:是一种裸露的,结构简单,独立于细菌染色体之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。工具限制性内切酶DNA连接酶载体来源原核生物大肠杆菌、T4噬菌体细菌质粒、噬菌体、动植物病毒等化学本质蛋白质蛋白质环状DNA分子（质粒）作用错位切：产生黏性末端平切：产生平末端连接同一种限制酶的切口（实质：恢复被限制酶切开的磷酸二酯键）（与DNA聚合酶进行区别）运载目的基因进入受体细胞特点专一性两种DNA连接酶作用性质稍有差别自我复制多酶切位点有标记基因对受体细胞无害备注“分子手术刀”根据切点不同，分类不同“基因缝合针”“分子运输车”识别特定脱氧核苷酸序列，并在特定位点切割（实质：断裂磷酸二酯键）在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）Ａ．同种限制酶B.两种限制酶Ｃ．同种连接酶D.两种连接酶练习Ａ注意：要用同一种限制酶切取目的基因和运载体，并用DNA连接酶连接。不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD练习双基练习：一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出符合人们需要的新的生物类型和生物产品。又叫做DNA重组技术。二、DNA重组技术的基本工具1.限制性核酸内切酶-----”分子手术刀”(1)主要来源:从原核生物中分离出来的.(2)特点:能够识别DNA特定的核苷酸序列,切开两个____之间的_____.(3)DNA末端:限制酶切割DNA产生的DNA末端有两种形式:______和_______.2.DNA连接酶----”分子缝合针”作用:将双链DNA____,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的______.

3.基因进入受体细胞的载体----”分子运输车”(1)载体的种类①质粒:是一种裸露的,结构简单,独立于细菌染色体之外,并具有自我_____能力的双链______DNA分子;②λ噬菌体的衍生物;③________.(2)载体的特点①能够在细胞内_______;②有一个或多个____切割位点,便于供源DNA的插入.③具有_____基因,供重组DNA的鉴定和选择.假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？如果不能分离会怎样？思考：对受体细胞无害，易分离．《化妆品术语》起草情况汇报中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所一、标准的立项和下达时间2006年卫生部政法司要求各标委会都要建立自己的术语标准。1ONE二、标准经费标准研制经费：3.8万三、标准的立项意义术语标准有利于行业间技术交流、提高标准一致性、消除贸易误差，作为标准体系中的基础标准，术语标准在各个领域的标准体系中均起着重要的作用。随着我国化妆品卫生标准体系建设逐步加快，所涉及的术语和定义的数量也在迅速增长，在此情形下，化妆品术语标准的制定就显得尤为重要。四、标准的制订原则1.合法性遵守《化妆品卫生监督条例》、《化妆品卫生监督条例实施细则》中关于化妆品的定义。2.协调性直接引用或修改采用的方式，与相关标准中的术语和定义相协调。3.科学性对于没有国标或定义不统一的术语，在定义时体现科学性的原则。4.实用性在标准体系中出现频率较高，与行业联系较紧密的术语优先选用。五、标准的起草经过

第一阶段：资料搜集

搜集国内外相关法规、标准、文献并对国外文献如美国21CFR进行翻译。第二阶段：2007年末形成初稿

初稿内容包括一般术语、卫生化学术语、毒理学术语、微生物术语、产品术语、人体安全和功效评价术语，常用英文成份术语等７部分。第三阶段：专家统稿1.2007年12月第一次专家统稿会（修订情况：1.在结构上增加原料功能术语、相关国际组织和科研机构等内容；2.在内容上增加一般术语、产品术语的种类，将化妆品行业的新产品类别纳入本标准；3.对于毒理学、卫生化学、微生物学术语进行修改；4.删除与化妆品联系不紧密、无存在必要的常用英文成分术语。2.2009年1月第二次专家统稿会会议意见：1.修改能引用国家标准的尽量引用国家标准；对存在歧义的个别用词进行修改。2.删除由于本标准中的“产品术语”一章和香化协会所制定的某个标准存在重复，因此删除“产品术语”一章的内容；对“原料功能术语”的内容进行梳理，删除了20余条内容。3.增加专家建议增加“化妆品限用物质”等若干项术语。第四阶段：征求意见2009年2月面向全国公开征求意见。第五阶段：征求意见的处理与形成送审稿。在征求意见的处理阶段再次征求了相关专家的意见。六、标准的内容依据1.《化妆品卫生监督条例》、《化妆品卫生监督条例实施细则》;2.《化妆品卫生规范》;3.美国21CFR；4.相关领域国家标准如：GB5296.3-2008消费品使用说明化妆品通用标签，GB/T14666-2003分析化学术语等；5.国内外化妆品的相关文献，如《化妆品监督管理及安全性评价》等。七、标准的结构和主要内容（一）结构：1.范围2.一般术语3.毒理学试验方法术语4.卫生化学检验方法术语5.微生物检验方法术语6.人体安全性和功效性评价术语7.常用原料术语8.缩写9.中英文索引（二）主要内容：1).一般术语39条涉及化妆品的基本定义、化妆品生产和监督管理中出现频率较高的术语。2).毒理学试验方法术语40条收录了《化妆品卫生规范》中涉及的术语，以及在毒理学领域出现频率较高、与化妆品毒理学试验方法联系较密切的术语。3).卫生化学检验方法术语22条收录了化妆品的卫生化学检验方法中较常用的术语。

4).微生物检验方法术语6条收录了《化妆品卫生规范》中所涉及的术语。5).人体安全性和功效性评价术语38条收录了人体安全性和功效性评价的常用术语。6).常用原料术语55条收录了常用原料术语，与《化妆品管理及安全性和功效性评价》保持一致，并根据企业、专家的意见进行了适当修改。7).缩写涉及国际机构缩写以及化妆品毒理学、化学、人体安全性和功效评价等领域专业术语的缩写34条。七、征求意见处理情况2009年2月20日，《化妆品术语》在全国公开范围内公开征求意见，截止到2009年3月末共收到来自企业、和社会各界的意见和建议共146条，分布情况如下：征求意见来源统计图二一般术语三毒理学四化学五微生物六人体七原料八缩写各部分征求意见采纳情况统计图二一般术语三毒理学