991108神经干细胞(5改)

/摘要近幾年神經幹細胞(NeuraｌＳtemＣell）因幹細胞（SｔemCelｌ）的崛起而變的熱門。而神經幹細胞的魔力在於其中的複雜性和高度變化特徵，對於世人來說非常具有神秘感。幹細胞的領域範圍很廣,主要是在探討細胞的分化潛力，讓其可以擔任身體的修復系統，最常拿來做討論的是胚胎幹細胞（Emｂryoｎicsｔemcellｓ;簡稱ES）,它具有發育的全能性,能分化出成體動物的所有組織和器官,而神經幹細胞就是從ES細胞分化出來的。神經幹細胞的開發將提供腦部衰老退化、神經萎縮等慢性疾病、腦損傷或脊髓損傷患者一個寬闊的治療方法.這些疾病包括帕金森氏症（Pａｒkｉnson＇sDisease)、阿茲海默症(Ａlzｈeｉmer＇sdiｓease；簡稱AＤ)、失智症（Demｅntia)。近年來，神經幹細胞的基礎和應用研究都取得了相當程度的進展，但仍有許多問題未能釐清，如移植的神經幹細胞,能被人體利用的程度有多大?移植的神經幹細胞與體內固有細胞間的相互作用為何?移植神經幹細胞增殖分化的關鍵因子是什麼?神經幹細胞移植到動物腦內後如何不併發致瘤性等等,這些都有待深入研究。ﻫ神經幹細胞的功能在於「再生新的神經細胞」，因此誘導分化的調控機制也就成為目前研究的重要課題。腦內神經元種類繁多且功能極為複雜，不同功能的神經元分布在不同部位，透過合成及釋放神經傳遞物質以發揮各自獨特的功能，但又需相互整合神經網絡的訊息。因此，即使能誘導神經幹細胞分化成所要的神經細胞，但細胞本身是否具有生理功能性，能否與周圍的神經形成適當的網絡，能否整合執行該有的生理功能,這些都有待亟需釐清。

而本專題將嘗試回顧神經幹細胞的培養、分化、還有其分化的神經組織，並探討其特性。目錄摘要.．．．．.．．。。。．．。．．。.。。...。.．。。。．。。．。。．．．。。．．．.。．。。..。.。。.。。．..．.．.。．。。.．。。．.。.。。。．。。。．.．...。.。.．。.。.。.．。01目錄..．。.．．．．..．.．．...．．.。。。。。。.。..。.．.。。。．．。。．。。。．..。。．。...．．...。．．。。。。。。.．．。.．。.。．。。。。.。．。。。。.。。．.．.。。。。．.．。０3表目錄。。．。．．。。．.。。．．。.。..．。.。．..。.．。。．.。。.。。。．.。。．．．.．。.。．。.．.。．。。。。.．．．.．。.。.。.。.。..．.。．．...。..．。．。．...。。．.。．。。05圖目錄.．。..．．.。。。。。.。..。。。．．.．.．..。。。．。..．..。..。。..。.．。.．。。．。。．．.．。。．．。。.。.．。...．.。.．．．。..．。．．..．..。.。。。。。．.。06緒論1.1前言。。..．.．．.。.。．．。。。.。.。．。。.．.．．。．。．.。．。。.。。．。..．.．。...。．。。。。.。.。..。.。．．。.．。．。。。。.。。.。.．。。．.．.。。。。071．1。1幹細胞的意義。．。。..．.．.。.．.。。..．。..．.．.。..。。。.。.。．...．。.．．.．。．。.。.．.．。..。．.。．.。.０71.1．2幹細胞的功用。。。．..。..。...。。.。.．。.。。..。．．.．.．.。。。.。．．．.．。..。．..。.．．。。。。.。。。．．．.．.．081.1．３目前常用的幹細胞。.．。。。.。.．．。..．。．...。．.．.．．．．．。．。。。。.。.。。。.．。．．。。．.。.。.．..。。...0８１．2神經幹細胞的概念。.。.。。．。.．..。。.。.。．.。。．。。。.．．．..．．.．．．．。.。。。.．.。。..。.。..。．.．．。．。．.．...．..。.10１．2。1神經組織（NervoｕsTiｓsue)的簡介.。.．...。.。．.。.。。.。..。。．．。。．．．。．.。。．.。1．２．２神經系統各部位的介紹．．．.．．．．.。..。．.。。..．.。。．...。.。．。.。。.．。．..．.。.。.。.。.．..。。。.。。１1１。3神經幹細胞的發展歷程．...．。。...。.．．。..．.。。.。.。.．。.．。．。．．.．.。．．...。。。..．．..．。．．。.．。。.12第二章神經幹細胞的臨床發展２.1神經幹細胞臨床應用的發展．。。.．．..。．.。。。..。.。.。．。。．.．．．.。。.．。.。。．.．。。．．.．.。。..。．..．..１5第三章神經幹細胞的分化與培養3.1各種培養途徑的樣品來源。.。．.。。...。。．。．．.。.。．.．。.。...。。．．.。。。.。．．.．．.．．。．。..。．。...。.。．.17３.2神經幹細胞的誘導分化。．.。。.。.。.。.．..．..．．．．...。.。.。。.。.。.。。..。．．。。.。.．..。．。。。.。．。.。1８3。3神經組織的培養。。．.。..。。．。．。。。。．.。．..。．。。。．．．...。．.。.。。.。。．..．．。。。...．。。．．．.。。。。.．。。．.。.．。203．4不同神經細胞型態特徵及其化學標誌。。。..。。.．。。.。.．..。。。。．...．．。...．.．．22第四章神經幹細胞的應用及問題．．。．．。。。。。。。..。..。。。。。．．。．．.。．。.。.。．。..。。...２34。1神經幹細胞的應用。.。.。。.．.。。.。。。.。。。.．．。.．.。．．。。．。.。。..。.．..。..．。．．.。.。.。。．．.。．.．。.。．..。。．。.234。1．1帕金森氏症．.．．。。.．。．．。.．.．．．..．..。。．.．.。。。．..．．．...。.．.．.．..。．.．.．.。．。.。。..。。．。。.．。.．．。.。.23４．1.2阿茲海默症。．。。.。。．.．．。.。.。。。。..。.．.。。。。。。。．。．。.。.。。．．。.．．．.。．.．..。..。。。．．.。。．．．。。.．。..２44。1.3神經損傷或其他神經功能喪失．．。。.。．..．。.。.．..．.．．。。.。．．。.。。..。.。.．．。。。.。2５4.2神經幹細胞的臨床問題.．.。.．。.。。。。。．.．.。．．。．.。。。．。.．．。。.．..．..。.．。。。.．..．．。。.。．.．．.．.254.2.１細胞移植治療的可靠性．。.．。。。。。.。。...。．．..．。．．．．。．.。．...．...．。.．。。．。．.．..．。．．。。．.。254.2。2細胞增殖的控制。．。.。．.。。。...。。。。.。。..。.。。．。．.。．．．。.．..。。．..．。.．..。.。.．。。.。..．。.。。．264。2。３神經突觸的連結。.．..。..。。...。。.。．．。..。．。.。..．.．.。．。．.。。.．．。.．．。．．.．.。．.。。。。．.。.。。。.．．..26第五章結論與未來展望.。。...．.。．...。。。.。．.．．.．.．..．。...。。。．。．。。．。..．．.。．。。.．．。.．．.。。。。。.。．。..2７參考文獻。.。.。..。。．。．．。.．。。.。．。．.。。．。．．．．。.。．。．．..．。.。。...。．。.．.。.．.．．.。.。。。。。.．．.．.。。。．.。.．.．．.。.。.．。.。...。２9表目錄表一、部分生長因子的使用情況………２1圖目錄圖一、胚胎幹細胞的研究前景…………0９圖二、神經幹細胞的分化圖……………1０圖三、不同種類的神經細胞……………12圖四、視黃酸為神經細胞過程中最常使用的化合物…20第一章緒論1.１前言在幾十年前，人們認為神經遭受破壞是無法修補的，而神經中樞的細胞在出生前或出生後不久就不再產生。1９８0年代中期，美國洛克菲勒大學兩位學者在研究金絲雀的發聲學習行為中,發現成年金絲雀腦中產生新的神經細胞,並且這些細胞有參與協調控制前腦的發聲與學習的機構。直到1９9２年科學家才發現可以自我分生的神經幹細胞存在,直到目前,對神經幹細胞的研究除了基本的社會道德問題困擾外，如何將神經幹細胞移植到中樞神經系統相關部位，並且讓其發揮作用而不會造成惡性增殖,是目前的研究重點1。1.1.１幹細胞的意義幹細胞(steｍcｅｌlｓ）是一群尚未完全分化的細胞，具有分化潛能及增殖的特性。其中胚胎幹細胞(Embryonicｓtemcｅll;EＳC）可形成體內所有類型的組織和細胞，甚至發育成一個完整的胚胎，又稱為全能性（ｔｏtipotency）幹細胞。隨著細胞分化，這種分化潛能逐漸受到局限，只能分化成有限細胞類型的細胞，稱為多潛能（pｌuripotency)細胞以及多能性（muｌtipotenｃy）細胞，最終成為單能幹細胞(monoｐotｅncｙ)或定向幹細胞（diｒｅｃtｉｏnalｓtemcell）2。幹細胞在生命體由胚胎發育到成熟個體的過程中,扮演最關鍵性的角色,即使發育成熟之後,一般相信幹細胞仍然普遍存在於生命體中,擔負著個體的各個組織及器官的細胞更新及損傷修復等重責大任。1.１.２幹細胞的功用由於幹細胞具有可以進一步分化為特定成體細胞的特性,因此除了可提供基礎學理研究，以做為探討胚胎發育與基因表現的優良材料外，其在再生醫學的研究領域裡，科學家也積極探討利用幹細胞配合組織工程的發展，期望用來修復因物理性、化學性、生物性所造成的損傷，或遭疾病侵害的成體細胞、組織及器官，使之重建或回復正常的功能。運用這項技術，對於一些因為細胞損傷或功能異常,而產生的病變以及退化性疾病,如帕金森氏症、阿茲海默症、糖尿病，慢性心臟病、退化性肌肉萎縮症、骨質疏鬆症、脊椎損傷等，以往認為是永久性失能的損傷，提供了一個矯正或治癒的願景3。1。１.3目前常用的幹細胞幹細胞在經過不同的分化因子分化後便會發展成不同性質的幹細胞進而發展出具有特殊功能的細胞，如心臟、肌肉、皮膚、紅血球等。目前用於體外培養常見的幹細胞有：胚胎幹細胞(Embryonicｓtemｃell）、神經幹細胞(NeuralStｅmCｅlｌ）、造血幹細胞（Hｅmatopoieticstｅmcｅll)、間質幹細胞(Mesenｃｈymalsteｍcｅll)、表皮組織幹細胞(Epiｄeｒmalstemcell)、胰島幹細胞（Pancreａｔｉｃｓtemcｅll）及生殖幹細胞（Gｅｎitalｓｔemcell）等。其中胚胎幹細胞用於疾病與藥物發展上，為各類幹細胞的主要來源(圖一）。然而，由於備具社會道德的爭議，使得胚胎幹細胞在研究上面臨相當大的困擾。另外,廣為人知的骨髓幹細胞以及臍帶幹細胞均為造血幹細胞的來源之一.圖一圖一本小組專題報告以神經幹細胞為主要探討目標，將神經幹細胞的形成與培養到臨床上的應用做個簡短的回顧,期待能對於有關神經幹細胞基礎及應用有進一步的了解。１.2神經幹細胞的概念神經幹細胞源自胚胎幹細胞，具未分化的、多潛能的、可自我更新的細胞，具有分化為神經元、寡突膠細胞和星狀膠細胞的潛能。神經幹細胞有兩種不同的分裂方式（圖二），一種是對稱分裂,即分裂後所產生的子代均為幹細胞;另一種為不對稱分裂，分裂後的子代分為兩類，一類是幹細胞，一類則是祖細胞(ｐｒogｅｎitor），神經祖細胞具有自我更新的能力，可逐步分化成熟為神經元或神經膠細胞４。圖二、神經幹細胞的分化圖。1.2。1神經組織(NeｒvｏusＴissｕe）神經系統（neｒvousｓystｅm）主要由中樞神經系統(ceｎtroｌｎｅrvouｓsyｓteｍ;CNS)及周圍神經系統(ｐeripheralnｅrvｏｕｓｓystem；PＮS）組成.中樞神經組織由神經元(ｎeｕｒon)、神經膠細胞（neｕrogliａ)組成。神經膠細胞又可分為星狀膠細胞(astroｃyｔｅ)、寡突膠細胞（ｏlｉgodｅndroｃｙtｅ）、微膠細胞（micrｏｇliａ)三種。周圍神經系統分為衛星細胞（saｔｅllitｅcelｌs)、許旺氏細胞（scｈｗaｎn'ｓcell)兩種.神經元：雖然不同的神經元的外型和大小不一樣，但其構造大致上都可分為三個部位:細胞體（celｌｂoｄy）、樹突（dｅｎdrite）和軸突（axon)。1。2.2神經系統各部位的介紹（圖三)（1).細胞體：指神經元膨脹部份,內有細胞核。其為神經元的營養中心，可合成多種巨大分子.（2）.樹突：由細胞體向外延伸出去的分支突起，為神經元的輸入通道,其功能是將自其他神經元所接收的動作電位傳至細胞本體５.(3）．軸突:由神經細胞的細胞本體長出較長突起,功能為傳遞細胞本體的動作電位至突觸.簡單的說,就是傳遞訊號的道路路口。（4)．星狀膠細胞：連結於腦微血管與神經之間的構造,主要功能為(1）提供神經元所需的營養物，如如葡萄糖等.(2)維持神經元周圍的離子平衡。（3)引導神經元移動的作用.(4)將神經細胞產生的廢物送到微血管的血液中５。(5)．寡突膠細胞:包圍在軸突外面，形成髓鞘（myeliｎsｈｅath）.可提供很好的絕緣性，幫助神經動作電位在軸突上可以快速地傳導（即所屬的跳躍式傳導)６.（6)。微膠細胞：主要功能在吞噬壞死或不正常之組織或細胞.在中樞神經系統中遊走，平時不活躍，但如有神經細胞壞死或神經細胞有其他病變時，微神經膠細胞就會被活化起來６.（7）.許旺氏細胞：出現在周邊神經系統中，圍繞神經細胞的軸突，提供周圍神經纖維在電位傳導上之絕緣,支持與保護，也可幫助神經元做電位跳躍式傳導6.(８）.衛星細胞：提供周邊神經系統中提供生理上的支持,如養份供給。圖三、不同種類的神經細胞.１．3神經幹細胞的發展歷程｢幹細胞｣這名詞最早出現在十九世紀的生物學文獻中，礙於技術上的不發達以及相關的佐證資料不足,直至１98３年由Sｕlstion以線蟲細胞系(ceｌllinｅage）研究證明了生殖系祖細胞具有自我更新的能力,這就是當今所認為的幹細胞的特徵。1967年，美國華盛頓大學的多納爾･托瑪斯發表骨髓移植可治療造血功能障礙。此後，幹細胞對臨床應用的研究就從血液系統展開。1998年美國威斯康辛大學的研究小組成功的從人體胚胎中分離出全能性幹細胞，並且在體外培養成功,而同年約翰·霍普金斯大學的研究小組也利用人類胚胎組織中建立了幹細胞株,此相培育也證實了具有全能幹細胞的特徵。由這兩項技術的突破，幹細胞工程的研究漸漸露出曙光，進而帶動了體外培育細胞、組織及器官的熱潮,而將幹細胞的體外培養技術用於疾病上的治療也因此新興起來7.神經幹細胞在1992年由Ｒeｙｎolds和Wｅiｓs等人利用neuｒosｐhere法成功地從小鼠的紋狀體分離出神經幹細胞，此細胞具有自我更新和分裂增殖的能力，可分化成神經系統大部分類型的細胞，對於損傷和疾病具反應能力，這項研究突破了以往人們對神經細胞無法再生的認知。1995年，由Gaｇｅ帶領的研究團隊在黏著性基質塗佈的培養皿上對成年大鼠海馬組織進行傳代培養,成功地獲得了以成年大鼠海馬組織為來源的神經幹細胞系。此舉也開啟了神經幹細胞在體外培養的研究之門。1９98年,日本學者Okａｎo和美國康乃爾大學的Goldmaｎ合作,以Musａｓhi作為標記物，在成人腦組織(主要取自於側腦室外側的腦室下帶)中證實了神經幹細胞的存在。１９9９年，美國洛克菲勒大學的Ｄoｅtscｈ等人報導成年哺乳動物腦內室下區的星形膠質細胞是具有自我複製能力和多向分化潛能的神經幹細胞。繼腦神經系統內成功的分離出神經幹細胞後,Weｉsｓ等人更於19９6年首度發表從成年哺乳動物的脊髓內也分離出神經幹細胞，此種神經幹細胞只有在ＥＧＦ和ｂＦGF共存的條件下才能產生具有自我更新能力的細胞團。這表示，脊髓神經幹細胞在增值分化調節方面與腦源性神經幹細胞有明顯的不同之處,但這項發表也代表了神經幹細胞不只有腦細胞中可以分離出來,也讓神經幹細胞的來源又增添了新發現８.第二章神經幹細胞的臨床發展早在十九世紀初,生物學家便對於體內神經系統裡的軸突在胚胎中的形成方式有著許多不同的看法,1８８6年胚胎學家WｉlheiｍＨｉs提出原始胚胎神經元或成體神經細胞的細胞質向外突起而形成軸突,並且不斷延伸,直至前端與周圍的感覺器官或肌肉纖維接觸時為止的假說。1890年SantiagoRamonyCaｊaｌ利用胚胎經組織切片的銀漬染色技術，支持了His的假說。1907年ＲossGｒａnvｉｌｌeHaｒriｓｏn利用外科技術設出哈里森懸滴培養法（HarrｉsｏnHangｉnｇｄrop)有力的證實Hiｓ和Gajaｌ的假說2。由這幾個細胞培養發展歷程來看,雖然有力證實了軸突的形成，但是神經幹細胞從何而來呢？2。１神經幹細胞臨床應用的發展在過去，對於腦內移植或神經組織移植的研究進展比較緩慢，主要是受到胚胎腦組織的來源、數量,以及社會法律和倫理等方面的限制.自從發現神經幹細胞的存在並能分離和培養成功，尤其是神經幹細胞株的建立可以無限的提供神經元和膠質細胞，解決了胚胎腦的移植數量不足問題，同時避免了倫理方面的爭論，為損傷後進行替代治療提供了充足的材料。根據研究顯示，幹細胞不僅有很強的增殖能力，而且尚有潛在的遷移能力，這點為治療病人因腦內代謝障礙而引起的廣泛細胞受損提供了理論依據，藉由幹細胞的遷移能力，可以避免多點移植所帶來的附加傷害。另外，神經幹細胞的移植也為研究神經系統發育及可塑性的實驗提供了觀察方法，為進一步臨床應用提供了理論基礎。由於現在已經能夠從發育中甚至成年中樞神經系統組織分離出具多潛能祖細胞或幹細胞特性的細胞來，因此，可以將這些細胞在體外擴增培養後直接植入神經系統的損傷或病變部位，分化為神經元、星狀膠細胞及寡突膠質細胞等等，進而緩解或修復損傷進而研究更深入的另一種應用途徑是將體外分離的神經幹細胞培養為永生化的神經祖細胞系（immoｒtaｌizｅdｎeuraｌｐroｇｅnitorceｌｌlinｅ），使之成為合適的體外基因轉殖載體。研究證明,將這些能夠表現各種外源性基因的載體植入發育中或損傷的中樞神經系統後,可以產生很有意義的影響及治療作用8。經過十幾年的研究,發現了神經細胞的再生契機，使得神經幹細胞的研究成為當今生命科學矚目的焦點之一。神經幹細胞在醫學上主要可應用在神經性退化疾病的治療、神經的再生與修復等，例如脊髓受傷、腦中風、阿茲海默氏症、帕金森氏症、腦部創傷等病患是最有可能的受惠者。在現在的研究中,也把神經幹細胞移植技術與基因治療結合,利用具有特定基因工程載體的神經幹細胞為治療工具，提供新的移植技術，以提升神經幹細胞在再生醫學上的應用價值1。第三章神經幹細胞的分化與培養為了滿足神經幹細胞在體外的研究和細胞治療時所需要的大量神經幹細胞,首要解決的問題是細胞的來源，目前常用的方法有三種：胚胎幹細胞(eｍbｒyoniｃstemｃeｌl；ＥＳ)或胚胎生殖幹細胞（ｅmbｒyoｎｉcｇerｍcell;ＥＧ）、胚胎幹細胞的細胞系和成體幹細胞4.3。1各種培養途徑的樣品來源（１)。胚胎幹細胞或生殖幹細胞：具有全能性，在特定的培養條件下可以誘導分化為神經幹細胞。(２)．成體幹細胞：在體內很少,在骨髓細胞中約只有1/10０0~１/150０0。神經幹細胞主要分布在室管膜區（位於前腦）、室管膜下區（SＶZ區,ｓubveｎtricｕｌａｒｚoｎe）、側腦室壁、海馬區（Hiｐpｏcaｍpus）及脊髓中也能分離出神經幹細胞。這些中樞神經系統（ＣNS）的幹細胞在促有絲分裂因子,如纖維母細胞生長因子－２（ＦibｒｏbｌaｓtGrowtｈＦaｃtor；FGＦ-2)和表皮生長因子（EｐidｅrmalGｒｏwthFactoｒ；EGF)存在的情況下,使其在體外增殖，去除有絲分裂因子後誘導分化，或使用其他細胞因子處裡細胞誘導其分化。另外，可塑性為成體幹細胞的一項特徵,即從一種組織分化為另一種組織,如造血幹細胞在特定培養的條件下分化為神經幹細胞。儘管其機制不明，但提示了細胞生長的微環境(nｉｃｈe）對細胞分化起著重要的作用。（3）.幹細胞的細胞系:細胞系是指從某初代培養開始通過連續培養所產生的所有細胞。目前有研究利用畸胎瘤和正常傳代培養的幹細胞細(D3、ROSA26)作為神經幹細胞的來源，利用細胞係作為治療用的移植細胞來源時，必須嚴格控制細胞的生長條件，避免細胞異常增殖和分化４。3.2神經幹細胞的誘導分化除了胚胎期的神經發育之外，最近的研究也指出，神經系統具有新生作用，成年人的腦也具有再生能力，而且這些新生的神經元可以移動到受損部位繼續發揮其功能，儘管其反應機制尚不清楚，人們依然朝這方面不間斷的研究。最近有以帕金森氏症做研究的發表指出，轉錄生長因子(tｒaｎsformingｇroｗｔｈfaｃtor—alpｈａ;TGF—α）在正常器官的修復過程中扮演著非常重要的角色.當TGF-α注入健康的大鼠腦內時,可以引起腦內室管膜下區的幹細胞大量增殖並且可以維持好幾天，然後消失。但將少量的TＧＦ－α注入已受損的大鼠腦內時，細胞增殖幾天後，幹細胞的遷移波（ｗaveofmigrａtｉｏn)會開始遷移至受損部位,這些神經幹細胞在受損的部位開始分化為多巴胺神經元4。成年人的神經幹細胞首先被發現於室管膜下區，該區具有會增殖的神經母細胞,同時也富含星狀膠細胞.在體外培養系統中，神經幹細胞會聚集成團，最後形成球形細胞團，稱為神經球(neｕrospherｅ）。培養的神經球，去除生長因子、降低血清濃度（２％~５%)後置於懸浮培養液中,在神經球內,僅有1０～１5%的細胞保留幹細胞的特性,其餘細胞則分化為神經前驅細胞（neｕrａｌpｒeｃurｓorceｌl；NPC)、神經元、寡突膠細胞和星狀膠細胞。這個體外分化過程和在體內狀況不同,因為在成年人的腦中，幾乎所有的神經幹細胞皆生成神經細胞,相反的，神經球的細胞較具有彈性,除了可生成神經細胞外，尚可分化成寡突膠細胞和星狀膠細胞.神經幹細胞的分化命運和周圍環境有關，如果將海馬區的幹細胞轉植於不會長出神經細胞的腦部區域，那麼長出來的大部分是膠原細胞,而非神經細胞，但如果將海馬區的幹細胞轉殖於下腦室區,則大部分長出的細胞是神經細胞和星狀膠細胞，可見神經幹細胞的分化受到環境因子的影響很大.體外分化可用特殊的分化誘導劑使其分化出我們所要的細胞，如：視黃醛酸（reｔinｏｉcaciｄ,ＲA)、二甲基亞碸（ｄiｍethylsulfoｘidｅ;ＤMSＯ）、γ—氨基丁酸、多肽生長因子（bFGF、ｔraｎsfｏrｍｉnｇgｒowthｆactｏr—β;TGF－β）等。其中RＡ是最常用的化學誘導劑４。RA最早是以畸胎瘤做研究，胚胎幹細胞研究普遍後,RＡ在幹細胞也被證實其可行性（圖四）。圖四、視黃醛酸（rｅtｉnoicacｉd;RＡ）,是於培養系統中誘導胚幹細胞分化為神經細胞過程中最常使用的化合物.3.３神經組織的培養細胞在體外的生存環境是人工模擬的,除了適當的溫度、空氣、無菌等條件外,最重要的是使細胞賴以生存的培養基接近於細胞體內的生理環境，確保細胞能夠正常地生存、生長，並維持其結構及功能.體外培養是讓細胞生活於培養基中，因此營養成分是必需的，為了使其生長環境接近於體內，促進生長因子、激素、滲透壓、ｐH等亦是必要的要求.其中促進生長因子可促進體內各種細胞群的生長，針對不同的細胞添加不同的生長因子,如培養培養神經細胞添加神經生長因子（NGF)，培養角質細胞添加表皮生長因子(EGF).當然有些生長因子可以刺激多種細胞的生長(表一）為部分生長因子的使用情況９.神經元在體外培養條件難以增殖,目前神經元主要以原代培養來培養.神經膠細胞是神經組織中易於培養的成分，在體外培養下可以分裂增殖,因此可進行傳代培養。神經元在體外培養方法可利用出生後一週內的大鼠腦組織或腦腫瘤培養,亦可利用神經幹細胞給予添加白血病抑制因子（leｕkaeｍｉaｉnhibiｔoryfactor；LＩF)、ＦGF-２和ＥGF等生長因子誘導分化而成.神經膠細胞的培養可利用新生一週內的大鼠腦組織處裡後添加培養基進行培養1０。生長因子一般培養的細胞特用培養的細胞建議濃度表皮生長因子(ＥｐideｒmａｌGｒowｔhFactoｒ，EGＦ）外胚層、中胚層細胞角質細胞、成纖維細胞、軟骨細胞等1～20nｇ/ｍl纖維母細胞生長因子(FibrｏblasｔGｒoｗｔｈFactor,FGF）中胚層細胞、神經外胚層細胞成纖維細胞、血管細胞等１~１00ｎg/ｍlbＦGF（basicfiｂroblastgrowｔhfacｔor)中胚層細胞、神經外胚層細胞內皮細胞、成纖維細胞、軟骨細胞、成肌細胞0。5~10ng/ml類胰島素生長因子1（Ｉnsulin－lｉkeGrowthFaｃtor,IGＦ—1)絕大多數細胞1～１0ng/ml血小板衍生生長因子(Plaｔｅlet-derivｅdgrｏｗtｈfａctoｒ,PDGF)間隙充質細胞成纖維細胞、成肌細胞、神經膠細胞1～50ng／ml神經生長因子(Nervｅgrowｔhfacｔor,ＮGF）感覺細胞、交感神經細胞神經細胞、神經膠細胞5～1０0ng/ｍlTransforｍｉnggrowthfactｏr－α,ＴGF—α刺激間隙充質細胞0.1~3nｇ/mlTranｓforminggrowthｆactoｒ－β,ＴGF—β抑制外胚層細胞1~10ng／ml表一、部分生長因子的使用情況3。4不同神經細胞型態特徵及其化學標誌在眾多的細胞群中,有些細胞本身會與所處的組織中的細胞很相似，在顯微鏡下很難分辨出來，為鑑別出各種細胞為何種是個難題，但有些細胞本身具有特殊的標誌，可以用於實驗室研究。誘導分化後的神經原細胞體較大,有長短不同的突起，細胞核比較大.其神經元標誌有特異性烯醇化酶(neuronalｓｐｅｃifｉcenoｌaｓｅ；ＮSE)、微血管相關蛋白(microtubuｌe－aｓsｏciａｔｅdpｒoｔein2；MＡP2)、神經絲(neurｏｆilament；ＮF）。星狀膠細胞的胞體較大為神經元的十倍大,呈不規則星狀,細胞核呈圓形,富含膠質,突起較多且比較細。星狀膠細胞常用的標誌為神經膠纖維酸性蛋白（ｇlialfｉｂｒillarｙacｉｄｉcｐｒｏｔeｉn；ＧFAP）、麩醯胺酸合成酶（gｌutaminesynｔhｅtaｓe）.寡突膠細胞胞體較小，突起短,細胞核呈圓形，膠質少.寡突膠細胞標誌為半乳糖腦苷脂（ｇaｌaｃｔoｃeｒｅｂroｓide;GC)及髓鞘鹼性蛋白（myeliｎｂasicｐｒｏteｉｎ;MBP);半乳糖腦苷脂為寡突膠細胞及髓鞘的主要類脂。而髓鞘鹼性蛋白(myelinbａsｉcprｏteiｎ；MBP）係寡突膠細胞在形成髓鞘前所表達的特異性蛋白４.第四章神經幹細胞的應用及問題在醫學上,施行神經幹細胞的治療雖還有一段距離，但喚起大家對幹細胞的研究熱潮。神經幹細胞的再生以及修復一直是熱門的研究的重點。此外,神經幹細胞的研究對於與神經相關藥物的開發、安全性和有效性等也有實用的價值。因為在藥物開發過程中,可由特定幹細胞或幹細胞分化的專一細胞做為試驗的標的，而不必進行耗時費力又昂貴的動物實驗,利用這項特性可開發出誘導或阻礙分化的醫療藥物.同時在研究正常細胞時，其來源也不再受限於有限且少量的活體組織，除了解決活體組織取得不足的困擾外，也可直接測試人類的正常神經細胞,以得到更精確的數據,並做為藥廠開發新藥的準則１。4．1神經幹細胞的應用近年來，帕金森氏症(Parkiｎson’sDiseaｓe)、阿茲海默症(Aｌzｈeiｍer’ｓdisｅase;簡稱AD)、失智症（Ｄｅmｅntiａ）等疾病均因神經損壞或者退化所造成，其對人們生理或者心理上極大的痛苦,我們在這裡做簡短的介紹。4。1．1其退化主要在中腦黑質細胞,使大腦無法正常分泌多巴胺，影響病患的情緒，多巴胺的不足會影響病患對肌肉的控制，帕金森氏症發生的原因有可能是吸食海洛英、鎂中毒或一氧化碳中毒,另外嗜睡型腦炎也會觸發。而誘發因子都會破壞腦中的黑質細胞,使黑質細胞退化，讓多巴胺不法正常分泌，而在1990年Lｉndvaｌｌ和他的工作隊員將３~4個約8至9個星期大的胚胎中取出黑質體腦細胞並植入一個患有帕金森氏症的病人中。由於腦組織和免疫系統被腦血管障壁隔離,因此捐贈細胞者不需和接受者有任何血源關係。5個月後,病人的黑核細胞生產了足夠的多巴胺，這含量的多巴胺足夠讓病人自由行動,這是幹細胞對帕金森氏症的影響４.４．1.阿茲海默病主要是神經細胞的損失（或退化），以及腦中出現類澱粉斑以及神經纖維叢,已知遺傳因素混影響阿茲海默症的發病。而調査顯示多攝取蔬菜、魚蝦類食物將減少患阿茲海默病的幾率、肉類的過多攝取則會使得機率提高。藍藻生物皆含有神經毒素BMＡA(β-N—ｍethylamino-L-aｌaｎine)，ＢMAA已證實會對動物產生強烈的毒性,加速動物腦神經退化、四肢肌肉萎縮等等，小量BMAA積累已能選擇性殺死從老鼠的神經元。藍藻門的生物包括髮菜、螺旋藻等等。香港中文大學呼籲大眾停止食用髮菜，減輕患上老人癡呆症的風險11。另外曾有抽煙攝取尼古丁能減少阿茲海默病的發病機率之說，但在大規模的研究後現此說法是否定的。而阿茲海默症和幹細胞的研究在於，如果能有效改善神經細胞的退化效率，並且再生出新的神經細胞,便可以改善阿茲海默症症狀。４.1.3神經損傷有些病患可能因為一些意外傷及神經,而經過神經接合過後可能會導致長期的該部位動作遲緩,經過復健可能還是無法回到當初靈敏的動作。而復健主要是在刺激該部位的神經系統,提升神經的接合.研究發現,如果長期經由運動或者由大腦中樞命令刺激受損的神經系統，該受損的神經一統會緩慢的連接並且復原，因為復健也助於建立新的神經回路,提高治療效果。而神經幹細胞的功用，不全然是再生新的神經元,也會分泌神經營養因子，保護垂死的神經元。4．2神經幹細胞的臨床問題神經幹細胞在臨床應用時,主要有三大難題，即細胞移植治療的可靠性、細胞增殖的控制及神經突觸的連結、發育生長問題.4.2．1目前進行的臨床實驗,所觀察到的療效並沒有得到令人滿意的進展。例如,腦卒中移植治療沒有證據說明移植細胞可通過梗死區和下運動神經元聯繫並發揮作用；帕金森病的細胞治療出現的療效和移植細胞生存狀態不匹配的問題等。與此同時，已經進行的很多臨床實驗都沒有發現長期療效，無法為細胞移植治療的可靠性提供直接證據。4.2.2細胞增殖的控制問題，係由於幹細胞植入後會有致瘤性的問題，而研究發現,神經細胞如果發展越成熟,植入人體之後就會有越高的機率增殖成細胞瘤.另外，如果利用體外培殖,所量產的細胞會品質不均,難以控制其細胞的生長速度以及成長程度。４.2。３